Embrión de pollo y sus vias de inoculación

RESULTADOS

Cavidad alantoidea Cavidad amniótica Saco vitelino

Figura 1. Estructura del embrión de pollo de 3 – 4 días de incubación.

Figura 3. Inoculación con azul de metileno en la membrana corioalantoidea.

Figura 5. Inoculación con azul de metileno en la cavidad alantoidea.

Figura 2. Inoculación con azul de metileno en la cavidad amniótica.

Figura 4. Cascarón del huevo con azul de metileno indicando la inoculación en membrana corioalantoidea.

Figura 6. Inoculación con azul de metileno en el saco vitelino del embrión.

ANÁLISIS DE RESULTADOS Los virus son parásitos intracelulares obligados, es decir, requieren de una célula hospedera viva para replicarse. Debido a esta necesidad, se han desarrollado diversas técnicas de cultivo de virus, la principal es en embrión de pollo de cinco a once días de incubación; éste método también es empleado para la caracterización y el diagnóstico viral, así como para la producción de vacunas. Lo anterior es posible gracias a las características propias del embrión y sus tejidos, pues éstos proporcionan un medio favorable para dicha replicación. Los huevos empleados para el aislamiento de los virus deben cumplir con ciertos requerimientos, entre ellos estar libres de patógenos específicos (SPF specific pathogenic free); lo anterior se refiere a que estén libres de enfermedades y que esto haya sido validado mediante pruebas de laboratorio y métodos clínicos puesto que el huevo es una vía por la cual se pueden adquirir diversos agentes patógenos. Los embriones de pollo son el medio de cultivo de virus por elección debido a que presentan muchas ventajas, entre ellas que están relativamente exentos de infecciones y contaminaciones (certificación SPF), son sensibles a la infección por muchos agentes virales, no forman anticuerpos contra los virus inoculados, además son baratos, se adquieren con facilidad y su tamaño hace más fácil su manipulación. Se deben tomar en cuenta también algunas condiciones que influyen sobre el crecimiento de los virus en los embriones como la vía de inoculación, dilución y cantidad de inóculo, la edad del embrión, temperatura y tiempo de incubación tras la inoculación. Para identificar la correcta proliferación viral es necesario la observación macroscópica y microscópica, en la primera se deben visualizar lesiones tales como hemorragias, congestión, enrollamiento, enanismo, presencia de pústulas, engrosamiento, fibrosis y edema de la membrana amniótica y la corioalantoidea, disminución del líquido amniótico, desarrollo anormal de las plumas y depósito de uratos en el estroma renal; en el análisis microscópico se deben identificar los efectos citopáticos como cuerpos de inclusión, pues debido a la propiedad hemoaglutinante del líquido amniótico y alantoideo, dichas afecciones ayudan a la diferenciación de cepas virales. Las estructuras que se observaron en el huevo y posteriormente en el embrión fueron una cámara de aire, ésta permite el intercambio gaseoso y se distribuye dentro del huevo por la membrana corioalantoidea la cual está altamente vascularizada y nos ayuda a la diferenciación de embriones vivos y muertos, sirve también como medio de respiración y se encuentra adyacente al cascarón. Con el desarrollo de esta membrana se da lugar a la cavidad alantoidea que, como su nombre lo dice, contiene el líquido alantoideo (cuyo volumen oscila entre 5 y 10 mL). Rodeando al embrión se encuentra la membrana amniótica formando la cavidad amniótica, el embrión está ligado al saco vitelino el cual se localiza céntrico en el huevo y proporciona los nutrientes necesarios para el correcto desarrollo. En la figura 1 se pueden observar el saco vitelino, cavidad alantoidea y cavidad amniótica. Cabe mencionar que el tiempo de gestación del embrión es fundamental para el desarrollo vírico, se recomienda que se empleen huevos que tengan entre cinco y once días de fecundación, pues si son de menos días es poco posible identificar las estructuras que lo conforman y por ende se dificulta la inoculación; y si es mayor a estos días el embrión posee un tamaño mayor y disminuye el volumen de los líquidos extraembrionarios. En la práctica se emplearon embriones de tres o cuatro días, se identificaron como tales por la ausencia de una cavidad alantoidea bien formada; por lo cual la inoculación en esta vía fue insatisfactoria, si bien se pudo alcanzar la parte desarrollada de esta cavidad, la mayoría del colorante inyectado se esparció en la yema (figura 5). Esta vía de inoculación es la más utilizada e importante debido a que el líquido alantoideo es una fuente antigénica de posible aplicación en las reacciones inmunológicas de diagnóstico. Así mismo se hizo la simulación de inoculación del saco vitelino (figura 6), en esta vía, debido a la inexperiencia en el manejo del ovoscopio la inoculación no fue de todo acertada, teóricamente los embriones de siete días son los más adecuados para emplearse; esta inoculación se utiliza principalmente para el aislamiento de bacterias del género Rickettsia sp. la observación de los embriones se debe hacer cinco días después de la inoculación y se deben incubar a 35°C; estas bacterias son Gram negativas, pequeñas y pleomórficas, pueden

ser aisladas en este tipo de medio debido a que no pueden sobrevivir fuera de su vector o reservorio durante periodos prolongados de tiempo. La inoculación en la membrana corioalantoidea se muestra en la figura 3 como una coloración en una fracción del embrión, que es la película que recubre el contenido del huevo. En la figura 4 se observa a detalle que la membrana adyacente al cascarón es color azul (por el colorante), por lo cual esta técnica fue satisfactoria. Los embriones que preferentemente se emplean para ser inoculados por esa vía son de nueve a doce días, son útiles para el aislamiento de virus vesiculares como la viruela y el virus del herpes, debido a que después de su replicación hay presencia de pústulas visibles. La incubación debe ser de 72 horas después de depositado el inóculo a una temperatura de 35°C. Para determinar que el virus se ha desarrollado, se deben identificar lesiones pequeñas redondeadas en forma de “rosario” para el agente causal de la viruela o lesiones ovaladas como “perla” en el caso del herpes virus. En la figura 2 se observa la coloración de la cavidad amniótica, que es el saco que contiene al embrión y al líquido amniótico. La inoculación por esta vía es muy simple, pues con la ayuda del ovoscopio se distingue fácilmente dónde se encuentra el embrión y por ende la cavidad. Se utiliza principalmente para el aislamiento del virus de la influenza y paperas, los embriones deben ser de ocho a diez días de incubados y se examina después de 72 horas de depositado el inóculo, se van a observar hemoaglutinaciones en el líquido amniótico (principalmente). El empleo de los embriones de pollo, además de servir para el diagnóstico de enfermedades virales, es utilizado para el desarrollo de vacunas, pues con la inoculación sucesiva de los virus éstos comienzan a atenuarse y con ello se facilita su manejo. La inoculación de un virus debe hacerse con sumo cuidado y el desarrollo se debe ovoscopiar a las 24 horas después de la infección debido a que si se presenta la muerte del embrión dentro de las primeras horas (antes de 24 h) se considerará deceso por traumatismo y las muertes ocurridas después de este periodo serán atribuidas al patógeno. CONCLUSIONES De acuerdo a los requerimientos fisiológico de los virus de conocieron las diferentes técnicas para el aislamiento de éstos, enfocándose en las diversas vías de inoculación del embrión de pollo; para ello fue necesario conocer las características físicas del embrión a diferentes días de incubación. Al utilizarse un huevo de tres o cuatro días de desarrollo no fue posible llevar a cabo satisfactoriamente la inoculación de la cavidad alantoidea ni del saco vitelino. REFERENCIAS Herrero, A. García, E. Hernández, A. Gómez, J. Infecciones por Rickettsias y fiebre Q. Medicine. 10 (57); 2010: 3881 – 3888. Saiz, L. García, J. Compaire, C. Animales de laboratorio: cría, manejo y control sanitario. España: Instituto Nacional de Investigaciones Agrarias, 1983. Herrero, L. Ávila, R. Corrales, E. Hun, L. Procedimientos en virología médica. Costa Rica: Editorial de la Universidad de Costa Rica, 2004. Manual de Prácticas de Laboratorio. Facultad de Veterinaria y Zootecnia. UAEMEX. [Internet] Consultado el 24 de mayo de 2017.Disponible en http://veterinaria.uaemex.mx/_docs/607_974_MP%20Virolog%C3%ADa.pdf Ramírez, E. Reconocimiento de los elementos del embrión de pollo y su empleo en virología. [Internet] Consultado el 24 de mayo de 2017. Disponible en http://matematicas.udea.edu.co/~actubiol/actualidadesbiologicas/raba1976v5n16art3.pdf Shors, T. Virus, estudio molecular con orientación clínica. Argentina: Editorial Médica Panamericana, 2006.