Traduccion Articulos VCD Thomas R. Rizzo

Spectroscopic studies of cold, gas-phase biomolecular ions Thomas R. Rizzo*, Jaime A. Stearns and Oleg V. Boyarkin Laboratoire de Chimie Physique Mole´culaire, E´cole Polytechnique Fe´de´rale de Lausanne, CH-1015 Lausanne, Switzerland (Received 13 April 2009; final version received 20 May 2009) While the marriage of mass spectrometry and laser spectroscopy is not new, developments over the last few years in this relationship have opened up new horizons for the spectroscopic study of biological molecules. The combination of electrospray ionisation for producing large biological molecules in the gas phase together with cooled ion traps and multiple-resonance laser schemes are allowing spectroscopic investigation of individual conformations of peptides with more than a dozen amino acids. Highly resolved infrared spectra of single conformations of such species provide important benchmarks for testing the accuracy of theoretical calculations. This review presents a number of techniques employed in our laboratory and in others for measuring the spectroscopy of cold, gas-phase protonated peptides. We show examples that demonstrate the power of these techniques and evaluate their extension to still larger biological molecules. Keywords: gas-phase biological molecules; cooled ion traps; electrospray; infrared spectroscopy

Contents page 1. Introduction 482 2. Experimental and computational approach 484 2.1 Overview 484 2.2 Ion generation 485 2.3 Cooling and trapping 485 2.4 Spectroscopic interrogation 486 2.5 Computational methods 487 3. Spectroscopy of protonated aromatic amino acids 488 4. The scaling of spectral complexity with increasing molecular size 494 5. Spectroscopy of helical peptides 495 6. Toward still larger molecules 503 *Corresponding author. Email: [email protected] ISSN 0144–235X print/ISSN 1366–591X online _ 2009 Taylor & Francis DOI: 10.1080/01442350903069931 http://www.informaworld.com Downloaded By: [Universidad Pablo de Olavide] At: 08:33 9 January 2010

7. Limitations and future directions 507 8. State of comparison with theory 509 9. Conclusions 511 Acknowledgements 512 References 512 1. Introduction Because the functions of biological molecules are intimately connected to their threedimensional structure, an enormous amount of effort is expended to determine the latter with the hope of understanding, and perhaps intervening in, the former. While biomolecular structure is determined primarily by x-ray crystallography and NMR, theory is playing an increasingly important role. As available computational power continues its exponential rise, increasingly large molecules become amenable to theoretical treatment. In addition to its potential predictive power, an accurate theoretical description of biological molecules allows one to dissect and analyse the counterbalancing forces that control their structure as well as to examine the properties of individual stable conformers. To make sure that theoretical treatments properly describe the underlying physics and are capable of reliably predicting structures, comparison with benchmark experiments is essential. Perhaps the most rigorous test is to compare theory and experiment on isolated biological molecules, free from the complicating effects of solvent. In the mid-1980s molecular spectroscopists began to remove biological molecules from their natural environment to interrogate them in the cold, isolated environment of supersonic molecular beams [1–9]. Early experiments used electronic spectroscopy to investigate the amino acid tryptophan with the goal of determining the number of stable conformations that it could adopt in vacuo [1–4]. This was driven by observations that the fluorescence decay rate of tryptophan in solution, which is used as a monitor of protein

folding, is non-exponential [10–12], and one of the models to explain these observations postulated the existence of different „conformers‟ having different fluorescence quenching rates[12]. Electronic spectra of isolated tryptophan did indeed identify a number of stable conformations[4], although at the time theoretical methods were not able to make reasonable predictions for these structures. Today the conformations of isolated amino acids can be easily and reliably calculated. The earliest experiments on isolated amino acids [1–4] and their derivatives [8,13,14] used simple heating to put them in the gas phase. With the advent of laser desorption techniques, larger, more complex molecules could be volatilised without decomposition [5–7, 15], and this helped ignite an explosion in spectroscopic studies of neutral peptides with up to 15 amino acid residues [5,6,9, 16–29]. The increasing complexity of these molecules require more sophisticated spectroscopic techniques to extract structural information, and this has been achieved by employing IR–UV [18–21,23,24,26, 30–40], UV–UV [30,33,36,41] and even IR–IR–UV multiple-resonance methods [42] together with cooling in supersonic expansions. 482 T. R. Rizzo et al. Downloaded By: [Universidad Pablo de Olavide] At: 08:33 9 January 2010

Still larger biological molecules become increasingly difficult to produce in the gas phase via thermal techniques without decomposition. The advent of MALDI [43,44] and electrospray [45,46] in mass spectrometry has allowed intact biological molecules of virtually any size to be put into the gas phase in the form of closed-shell molecular ions and opened up new avenues of investigation. Bowers and co-workers used these techniques together with ion mobility to characterise the average cross section of such species [47,48]. Wang and co-workers measured photoelectron spectra of multiply-charged, non-biological anions generated by electrospray [49], and Parks and co-workers observed fluorescence from cytochrome C in an electrospray plume [50] and later from small proteins in a quadrupole ion trap [51]. However it was Andersen et al. [52,53] who first used absorption/ action spectra to characterise closed-shell biomolecular ions produced by electrospray. These groundbreaking experiments measured electronic absorption spectra of green fluorescent protein chromophore in an electrostatic ion storage ring by detecting the neutral products subsequent to either photodetachment (in the case of anions) or photofragmentation (in the case of cations). The spectra they obtained exhibited only broad structure, although this is likely due to the warm internal temperatures of the ions in the storage ring. At about the same time, McLafferty et al. [54,55] demonstrated that one could do infrared multiphoton dissociation (IRMPD) of electrosprayed peptides and proteins in a Fourier transform ion-cyclotron resonance (FT-ICR) mass spectrometer using an optical parametric oscillator (OPO) operating in the light-atom stretch region. Tuning the frequency of their IR OPO produced photofragment excitation spectra that reflect the infrared absorption of OH and NH stretch vibrations. Even though the ions in their trap were at room temperature, the observed bands were about 30 cm _1 wide, which is sufficiently narrow to distinguish many light atom stretch bands. Von Helden et al. [56] extended IRMPD spectroscopy into the amide I and II regions of the infrared using a free electron laser to measure infrared spectra of potassiated cytochrome C ions formed by electrospray, where detection of infrared absorption was monitored by the loss of the potassium adduct. Although the individual bands in these spectra were rather broad (30–50 cm_1), the overall vibrational pattern in this region suggests a large degree of _-helical content. Shortly thereafter, Kamariotis et al. [57] measured infrared spectra of solvated amino acid ions to look for evidence of zwitterion formation by detecting solvent loss subsequent to IR absorption. These spectra were used to test the claim that after adding 3–4 water molecules a cationised amino acid exists in a salt-bridge arrangement with the amino acid in a zwitterionic form [58]. While all these studies broke new ground in providing spectroscopic data to help characterise the conformational properties of closed-shell biomolecular ions, the spectral complexity was substantially greater and the resolution correspondingly lower than studies of neutrals cooled in supersonic expansions. Simons et al. [59–61] developed a photochemical method for producing protonated biological molecules in a supersonic expansion, and while perhaps not the most widely applicable, this approach demonstrated that the spectra of closed-shell ions are inherently no more complex than their corresponding neutrals. As the size and spectral complexity of the molecules increase, cooling the molecules is simply necessary to facilitate spectroscopic analysis. In a major step toward spectroscopic studies of cold, biomolecular ions, Weinkauf

et al. [62] measured the electronic excitation spectrum of protonated tryptophan produced by electrospray and stored in a liquid-nitrogen-cooled quadrupole ion trap. While the International Reviews in Physical Chemistry 483 Downloaded By: [Universidad Pablo de Olavide] At: 08:33 9 January 2010

electronic spectrum they obtained showed some structure, the spectral features were orders of magnitude broader than molecules cooled in a supersonic expansion, leading one to question the cooling efficiency in their trap. It was later discovered that the spectrum of protonated tryptophan is inherently broad due to fast excited state dynamics [63]. Nevertheless, Weinkauf‟s [62] experiments served as a major stimulus to study electrosprayed ions in cold traps. This present article reviews the work currently being done in the authors‟ laboratory combining electrospray ionisation for producing gas-phase biomolecules together with collisional cooling in a cold 22-pole ion trap and IR–UV double-resonance techniques to simplify the spectra. The primary goals of this work have been to understand the intrinsic properties of biological molecules and provide critical benchmark tests of theory, and for this we look at bare, isolated molecules in the gas phase. While as a test of theory, the spectroscopy of gas-phase biomolecules has relevance completely apart from their condensed phase analogs, the closed-shell molecular ions produced by electrospray are the same species found in solution, where most biomolecules carry a net charge. Moreover, by examining partially solvated molecules in the gas phase, we can begin to understand the role of solvent on those properties. 2. Experimental and computational approach 2.1. Overview We perform our experiments in a home-built ion-trap mass spectrometer, shown schematically in Figure 1. Rather than give a detailed description of this apparatus, which can be found in recent publications [64–70], we provide a brief overview of the experimental approach followed by an explanation of key aspects of the experimental design. Figure 1. [Colour online] Schematic of tandem mass spectrometer with a cooled, 22-pole ion trap. Adapted with permission from [86]. Copyright 2006 American Chemical Society.

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We use a nanospray source to produce the protonated peptides from an acidified water/methanol solution directly into the atmosphere, where they are drawn into vacuum by a metal-coated glass capillary. The expansion that occurs at the exit of the capillary passes through a 1mm diameter skimmer and into a hexapole ion trap, where the ions are collected for _50 ms. Once released from the hexapole, the resulting ion packet passes through a quadrupole mass filter to select those of a particular m/z. The transmitted ions are then turned 90_ by a static quadrupole deflector, decelerated by a series of lenses and guided by an octopole ion guide into a 22-pole ion trap, which is cooled to _6K by a closed-cycle refrigerator. Before the ion packet arrives in the trap, we inject a pulse of helium, giving it sufficient time to equilibrate to the temperature of the trap housing. The ions collide with the cold helium and fall in to the effective potential well of the trap. We give the ions approximately 10 ms to cool and then wait an additional 30 ms to pump out the helium before we interrogate them spectroscopically. We pass a UV laser pulse from a frequency-doubled dye laser down the axis of the 22-pole ion trap, promoting the molecules to an excited electronic state from which some fraction of them dissociate. We then release both the parent and fragment ions from the trap, turn them 90_ in a second static quadrupole and pass them through an analysing quadrupole to select an m/z of either a particular fragment or of the parent ions. The transmitted ions are then detected by a channeltron electron multiplier. An electronic spectrum is obtained by recording the ion signal of a particular fragment as a function of the frequency of the UV laser. As is described more fully below, we measure infrared spectra of the trapped biomolecular ions using IR–UV double resonance. The trapping cycle of the ions is repeated at 20 Hz. We switch the analysing quadrupole to transmit either the fragment or the parent on alternate trapping cycles and use the parent signal from one shot to normalise the fragment signal from the subsequent one, which removes long-term fluctuations in the nanospray source. 2.2. Ion generation Putting biological molecules into the gas-phase via electrospray has many advantages for spectroscopic studies. Because they are produced near room temperature and at

atmospheric pressure, there is essentially no fragmentation. There seems to be no limit to the size of molecules that can be produced – those ranging from individual amino acids to entire viruses [71–73] have been successfully injected into mass spectrometers by electrospray. Because we are working with charged biomolecules as opposed to neutrals, we can select their mass and control their trajectories, allowing us to guide and/or trap them. Electrospray generates closed-shell molecular ions, either protonated or deprotonated, which is precisely what is found in solution. The disadvantage of studying biomolecular ions is the relatively low number density, which is a function both of the electrospray process itself as well as space charge effects inside the ion trap. 2.3. Cooling and trapping The linear, 22-pole ion trap is the key element of our experimental apparatus, allowing us to store the molecules and cool them through collisions with cold helium. Gerlich et al. [74–76] pioneered the use of cold, RF ion traps and applied them principally to study the International Reviews in Physical Chemistry 485 Downloaded By: [Universidad Pablo de Olavide] At: 08:33 9 January 2010

spectroscopy and chemical reaction kinetics of small ions of astrophysical importance. There is nothing particularly special about the choice of 22 poles – it is simply important to have a sufficiently large number of them so that the effective radial potential is flat for a substantial fraction of the trap diameter [76]. As the ions ride up the radial potential wall when they approach the poles, they undergo oscillatory motion driven by the RF field, and collisions with helium at this point could warm the ions as opposed to cooling them. Thus a flat radial potential with steeper walls should facilitate collisional cooling of ions, since in this case the oscillatory motion and hence warming collisions, will be limited to a small fraction of the trap volume. The drawbacks to using a larger number of poles is that the ions spread over a larger volume resulting in a lower ion density on the axis of the trap, and optical access to the trapped ions in the radial direction is limited. 2.4. Spectroscopic interrogation We typically inject 10,000 ions into the 22-pole trap, which has an active volume of _5 cm. Given the ion density of _2_103 cm_3, it is clear that any kind of direct absorption spectroscopy would be difficult if not impossible. Moreover, this ion density is at the limit of what can be detected by laser-induced fluorescence (LIF), a problem that is compounded by the unfavourable geometry of the 22-pole ion trap for photon detection. We thus need a more sensitive means of spectroscopic detection, and for this we use photofragmentation. After UV excitation of an aromatic chromophore in a protonated peptide, some fraction of the ions will fragment, since quantum yields for fluorescence are rarely unity. This can occur either following internal conversion to highly excited vibrational levels of the ground electronic state or by crossing to other electronic states that are dissociative in some coordinate. We thus use mass-resolved detection of photofragments as a sensitive spectroscopic tool. As shown schematically in Figure 2a, we measure electronic spectra of the cold ions in the trap by detecting a particular charged photofragment as a function of the UV wavelength. Our ultimate goal is to measure infrared spectra of biomolecular ions, since such spectra can provide information on the conformation of the molecule. Using an IR–UV double-resonance scheme, illustrated schematically in Figure 2b, we can measure an IR spectrum of individual conformers of the trapped ions. To do this, we fire an infrared pulse from an OPO 200 ns before the UV pulse, depleting the ground state population each time the infrared frequency coincides with a vibrational transition of the parent molecule. The IR transition is then detected as a dip in the UV photofragmentation signal as the IR frequency is scanned through a vibrational band. For this approach to work, the molecules promoted to a vibrationally excited state must not absorb a UV laser photon of the same frequency as that of the ground state and produce fragments, or if they do, it must be with reduced efficiency. Because the IR-excited molecules will be internally warm, we observe their UV absorption spectrum is substantially broadened and the peak absorption at the UV wavelength is greatly reduced, leading to a dip in the IR spectrum. While this double-resonance approach imposes the requirement that the molecule of interest have a UV chromophore, it has the great advantage that the UV spectrum can be used to select a particular conformer, since different conformers often have slightly different UV spectra that can be resolved if the molecules are internally cold. Thus, the IR 486 T. R. Rizzo et al. Downloaded By: [Universidad Pablo de Olavide] At: 08:33 9 January 2010

Los estudios espectroscópicos de los iones de frío, biomolecular en fase gaseosa Thomas R. Rizzo *, Jaime A. Stearns y Oleg V. Boyarkin Laboratoire de Chimie Physique Mole'culaire, E'cole Fe'de'rale Polytechnique de Lausanne, CH-1015 Lausanne, Suiza (Recibido el 13 de abril de 2009, versión final recibió el 20 mayo de 2009) Si bien el matrimonio de la espectrometría de masas y la espectroscopia láser no es nueva, los acontecimientos de los últimos años en esta relación se han abierto nuevas horizontes para el estudio espectroscópico de moléculas biológicas. La combinación de ionización de electrospray para la producción de grandes moléculas biológicas en el gas fase, junto con las trampas de iones enfriados y múltiples esquemas de resonancia láser que permita una investigación espectroscópica de conformaciones individuales de los péptidos con los ácidos más de una docena de aminoácidos. Espectros de infrarrojo altamente resuelto de una sola conformaciones de estas especies constituyen puntos de referencia importantes para las pruebas de la exactitud de los cálculos teóricos. Esta revisión presenta una serie de técnicas empleadas en nuestro laboratorio y en otros para medir la espectroscopia de frío, en fase gaseosa péptidos protonada. Se muestran ejemplos que demostrar el poder de estas técnicas y evaluar su extensión a los todavía grandes moléculas biológicas. Palabras clave: fase gaseosa las moléculas biológicas, las trampas de iones enfriados; electrospray; espectroscopia de infrarrojo Contenido de la página 1. Introducción 482 2. Enfoque experimental y computacional 484 2.1 Resumen 484 2.2 Ion generación de 485 2.3 Refrigeración y captura 485 2.4 espectroscópicos interrogatorios 486 2.5 Métodos computacionales 487 3. Espectroscopia de protonadas aminoácidos aromáticos 488 4. La escala de la complejidad del espectro con el aumento del tamaño molecular 494 5. Espectroscopia de péptidos helicoidales 495 6. Hacia las moléculas aún mayores 503 * Autor para la correspondencia. Correo electrónico: @ thomas.rizzo epfl.ch ISSN 0144-235X de impresión / ISSN 1366-591X en línea _ 2009 Taylor & Francis DOI: 10.1080/01442350903069931 http://www.informaworld.com Descargado por: [Universidad Pablo de Olavide] En: 08:33 09 de enero 2010 7. Limitaciones y las direcciones futuras 507 8. Estado de comparación con la teoría 509 9. Conclusiones 511 Agradecimientos 512 Referencias 512 1. Introducción Dado que las funciones de las moléculas biológicas están íntimamente conectados con sus tres dimensiones estructura, una enorme cantidad de esfuerzo se realiza para determinar la última con la esperanza de entender, y quizás intervenir en la primera. Mientras que estructura biomolecular está determinada principalmente por cristalografía de rayos X y RMN, La teoría está desempeñando un papel cada vez más importante. Como la potencia de cálculo disponible

continúa con su crecimiento exponencial, cada vez más grandes moléculas susceptibles de ser teóricas el tratamiento. Además de su potencial poder de predicción, una descripción teórica precisa de las moléculas biológicas permite diseccionar y analizar las fuerzas de contrapeso que el control de su estructura, así como para examinar las propiedades de los distintos confórmeros estables. Para asegurarse de que los tratamientos teóricos adecuadamente describir la física subyacente y se capaz de predecir de forma fiable las estructuras, la comparación con los experimentos de referencia es esenciales. Quizás la prueba más rigurosa es la comparación de la teoría y la experimentación en aislados las moléculas biológicas, libre de los efectos que complica de disolvente. En el espectroscopistas mediados de 1980 comenzó molecular para eliminar las moléculas biológicas de su medio ambiente natural para interrogarlos en el ambiente frío, aislado de supersónico haces moleculares [1-9]. Los primeros experimentos utilizó la espectroscopia electrónica investigar el aminoácido triptófano, con el objetivo de determinar el número de estable conformaciones que puede adoptar en el vacío [1-4]. Esto fue impulsado por las observaciones que el tasa de decaimiento de fluorescencia de triptófano en la solución, que se utiliza como un monitor de la proteína plegado, no es exponencial [10-12], y uno de los modelos para explicar estas observaciones postuló la existencia de diferentes confórmeros "con extinción de fluorescencia diferentes las tasas [12]. Los espectros electrónicos de triptófano aislados, efectivamente, identificar una serie de estable conformaciones [4], aunque en el momento de métodos teóricos no fueron capaces de hacer predicciones razonables para estas estructuras. Hoy en día la conformación de aminoácidos aislados Los ácidos pueden ser fácil y confiablemente calculado. Los primeros experimentos en aminoácidos aislados [1-4] y sus derivados [8,13,14] utiliza calentamiento simple para ponerlos en la fase gaseosa. Con la llegada de desorción por láser técnicas, moléculas más grandes y complejas pueden ser volatilizados sin descomposición [15 5-7], y esto ayudó a encender una explosión en los estudios espectroscópicos de péptidos neutral con hasta 15 residuos de aminoácidos [5,6,9, 16-29]. La creciente complejidad de estas moléculas requieren técnicas espectroscópicas más sofisticados para extraer estructurales , la información, y esto se ha logrado mediante el empleo de IR-UV [18-21,23,24,26, 30-40] UV UV-[30,33,36,41], e incluso IR-IR-UV de múltiples métodos de resonancia [42], junto con de enfriamiento en las expansiones supersónicas. 482 T. R. Rizzo et al. Descargado por: [Universidad Pablo de Olavide] En: 08:33 09 de enero 2010 Aún más grande de moléculas biológicas cada vez más difícil de producir en el gas fase a través de técnicas termales sin descomposición. El advenimiento de MALDI [43,44] y electrospray [45,46] en la espectrometría de masas ha permitido intactas las moléculas biológicas de prácticamente cualquier tamaño que se pondrán en la fase de gas en forma de capa cerrada iones moleculares y abrió nuevas vías de investigación. Bowers y colaboradores utilizan estas técnicas junto con la movilidad de iones para caracterizar la sección transversal media de estas especies

[47,48]. Wang y sus colaboradores midieron los espectros de fotoelectrones de multiplicar cargado, no biológicos aniones generados por electrospray [49], y Parques y compañeros de trabajo observó fluorescencia de citocromo C en un penacho de electrospray [50] y más tarde a partir de pequeñas proteínas en un cuadrupolo trampa de iones [51]. Sin embargo, fue Andersen et al. [52,53], quien utilizó por primera vez la absorción / espectros de acción para caracterizar con cáscara cerrada iones biomoleculares producido por electrospray. Estos experimentos innovadores medir los espectros de absorción electrónica de color verde cromóforo proteína fluorescente en un anillo de iones de almacenamiento electrostático mediante la detección de la productos neutros o con posterioridad a photodetachment (en el caso de aniones) o photofragmentation (en el caso de cationes). Los espectros obtenidos se exhiben sólo estructura general, aunque esto es probablemente debido a las altas temperaturas internas de los iones en el anillo de almacenamiento. Al mismo tiempo, McLafferty et al. [54,55] demostraron que una podía hacer por infrarrojos disociación multifotónica (IRMPD) de los péptidos y electrosprayed las proteínas de una transformada de Fourier de iones de resonancia ciclotrón (FT-ICR) espectrómetro de masas utilizando un oscilador óptico paramétrico (OPO) que operan en la región se extienden la luzátomo. Sintonización de la frecuencia de su IR OPO producido photofragment espectros de excitación que reflejan la absorción infrarroja de las vibraciones se extienden OH y NH. A pesar de que los iones en la trampa estaban a temperatura ambiente, las bandas se observaron alrededor de 30 cm_1 de ancho, que es lo suficientemente estrecha para distinguir la luz muchas bandas elásticas átomo. Von Helden et al. [56] espectroscopia extendido IRMPD en la amida I y II regiones del infrarrojo utilizando una libre láser de electrones para medir los espectros infrarrojos de potassiated citocromo C formado por iones electrospray, que se monitorizó la detección de absorción infrarroja por la pérdida de el aducto de potasio. A pesar de las bandas individuales en esos espectros fueron bastante amplio (30-50 cm_1), el patrón general de vibración en la región sugiere un alto grado de _-Helicoidal contenido. Poco después, Kamariotis et al. [57] midieron los espectros infrarrojos de solvatados iones de aminoácidos para buscar evidencia de la formación de zwitterion mediante la detección de disolventes consecuente pérdida de absorción de infrarrojos. Estos espectros se utilizaron para probar la afirmación de que después de la adición de moléculas de agua 3-4 un aminoácido cationised existe en un acuerdo de salpuente con el aminoácido en forma de iones híbridos [58]. Aunque todos estos estudios abrió un nuevo camino en el suministro de los datos espectroscópicos para ayudar a caracterizar las propiedades conformacionales de iones biomoleculares con cáscara cerrada, el espectro

complejidad era mucho mayor y la resolución proporcionalmente menor que en los estudios de los neutrales se enfrió en expansiones supersónicas. Simons et al. [59-61] desarrollaron un método fotoquímico para la producción de moléculas biológicas protonado en un supersónico de expansión, y aunque quizá no el más ampliamente aplicable, este enfoque ha demostrado que los espectros de capa cerrada iones no son inherentemente más complejos que sus neutrales correspondientes. A medida que el tamaño y la complejidad del espectro del aumento de las moléculas, enfriamiento de las moléculas no es más que necesaria para facilitar el análisis espectroscópico. En un gran paso hacia los estudios espectroscópicos de iones de frío, biomolecular, Weinkauf et al. [62] midieron el espectro de excitación electrónica de triptófano producido protonadas por electrospray y se almacena en una trampa de iones de nitrógeno líquido refrigerado cuadrupolo. Mientras que el Comentarios Internacional de Química Física 483 Descargado por: [Universidad Pablo de Olavide] En: 08:33 09 de enero 2010 espectro electrónico que obtuvieron mostraron algún tipo de estructura, las características espectrales eran órdenes de magnitud mayor que las moléculas de refrigeración en una expansión supersónica, lo que lleva a un tela de juicio la eficacia de la refrigeración en su trampa. Más tarde se descubrió que el espectro de triptófano protonada es de por sí amplio debido a la rápida dinámica de estado excitado [63]. Sin embargo, [62] Weinkauf los experimentos fue un importante estímulo para el estudio electrosprayed iones en trampas frías. Este trabajo revisa el trabajo que se está realizando en el laboratorio de los autores la combinación de ionización electrospray para la producción de biomoléculas en fase gaseosa con refrigeración de colisión en un frío de 22 polos de trampa de iones y IR-UV resonancia doble técnicas para simplificar los espectros. Los objetivos principales de este trabajo ha sido comprender el valor intrínseco propiedades de las moléculas biológicas y proporcionar pruebas de referencia fundamental de la teoría, y para esto nos fijamos en las moléculas de desnudo, aislado en la fase gaseosa. Mientras que como una prueba de la teoría, la espectroscopia de biomoléculas en fase gaseosa tiene una importancia completamente al margen de su análogos de la fase condensada, los iones moleculares de capa cerrada producida por electrospray son los misma especie se encuentra en solución, donde la mayoría de las biomoléculas tienen una carga neta. Por otra parte, por el examen de moléculas parcialmente solvatado en la fase de gas, podemos empezar a entender el papel de disolvente en esas propiedades. 2. Enfoque experimental y computacional 2.1. Información general Llevamos a cabo nuestros experimentos en un espectrómetro de masas de iones de fabricación casera-trampa, que se muestra esquemáticamente en la figura 1. En lugar de dar una descripción detallada de este aparato, que se puede encontrar en las publicaciones recientes [64-70], ofrecemos una breve descripción de la enfoque experimental seguida de una explicación de los aspectos clave de la experimentación

diseño. Figura 1. [Color en línea] Esquema del espectrómetro de masas en tándem con un refrigerado, 22 polos de trampa de iones. Adaptado con permiso de [86]. Copyright 2006 Sociedad Americana de Química. 484 T. R. Rizzo et al. Descargado por: [Universidad Pablo de Olavide] En: 08:33 09 de enero 2010 Utilizamos una fuente nanospray para producir los péptidos protonadas de un acidificados agua / metanol directamente en la atmósfera, donde se dibujan en el vacío por un vaso de metal con recubrimiento capilar. La expansión que se produce a la salida del capilar pasa a través de un skimmer de 1 mm de diámetro y en una trampa de iones hexapole, donde los iones son recogidos para _50 ms. Una vez liberado de la hexapole, el paquete de iones resultante pasa a través de un filtro de masas cuadrupolar para seleccionar a los de un determinado m / z. Los iones de transmisión Luego se convirtió 90_ por un deflector cuadrupolo estática, se desaceleró por una serie de lentes y guiado por un guía de iones octopolar en una trampa de iones de 22 polos, que se enfría a _6K por un refrigerador de ciclo cerrado. Antes de que el paquete de iones llega a la trampa, se inyecta un pulso de helio, dándole tiempo suficiente para equilibrarse con la temperatura de la caja trampa. La iones colisionan con el frío de helio y la caída en el potencial efectivo y de la trampa. Nosotros dar a los iones de aproximadamente 10 ms para enfriar y luego esperar otros 30 ms para bombear el helio antes de interrogarlos espectroscópicamente. Pasamos por un pulso de láser UV a partir de una doble frecuencia láser de colorante por el eje de la 22 polos trampa de iones, la promoción de las moléculas de un estado electrónico excitado de que algunos parte de ellos se disocian. A continuación, suelte ambos el padre y los fragmentos de iones de la trampa, a su vez les 90_ en un cuadrupolo estática segundo y pasar a través de un análisis de cuadrupolo para seleccionar una m / z de cualquiera de un fragmento en particular o de los iones de los padres. La iones de transmisión son detectados por un multiplicador de electrones channeltron. Un sistema electrónico espectro se obtiene mediante el registro de la señal de iones de un fragmento en particular en función de la la frecuencia del láser UV. Como se describe más detalladamente a continuación, se mide por infrarrojos espectros de los iones atrapados biomolecular con IR-UV de doble resonancia. El ciclo de captura de los iones se repite en 20 Hz. Cambiamos el cuadrupolo analizar ya sea para transmitir el fragmento o el padre de los ciclos alternos de captura y el uso de la señal de los padres de un disparo a normalizar la señal fragmento de la siguiente, que elimina fluctuaciones a largo plazo en la fuente nanospray. 2.2. Ion generación Poner las moléculas biológicas en la fase de gas a través de electrospray tiene muchas ventajas para estudios espectroscópicos. Porque se producen a temperatura ambiente y en presión atmosférica, esencialmente no hay fragmentación. Parece no haber límite con el tamaño de las moléculas que se pueden producir - que van desde los aminoácidos

individuales a los virus de todo [71-73] han sido exitosamente inyecta en los espectrómetros de masas por electrospray. Porque estamos trabajando con las biomoléculas cargadas y no a los neutrales, podemos seleccionar su masa y el control de sus trayectorias, lo que nos permite orientar y / o trampa ellos. Electrospray genera con cáscara cerrada iones moleculares, ya sea protonadas o desprotonada, que es precisamente lo que se encuentra en solución. La desventaja de estudiar iones biomoleculares es la densidad del número relativamente bajo, lo cual es una función tanto de la electrospray proceso en sí mismo, así como los efectos de carga espacial dentro de la trampa de iones. 2.3. De enfriamiento y captura El lineal, 22 polos de trampa de iones es el elemento clave de nuestro aparato experimental, lo que permite nos para almacenar las moléculas y fresco a través de colisiones con el frío de helio. Gerlich et al. [74-76] fue pionero en el uso de trampas de frío, de iones de radiofrecuencia y las ha aplicado principalmente para estudiar la Comentarios Internacional de Química Física 485 Descargado por: [Universidad Pablo de Olavide] En: 08:33 09 de enero 2010 espectroscopia y cinética de la reacción química de los iones pequeños de la importancia astrofísica. No hay nada particularmente especial en la elección de 22 polos - es simplemente importante tener un número suficiente de ellos para que el potencial radial efectivo se fija por un parte sustancial de la trampa de diámetro [76]. Como los iones de subir la barrera de potencial radial cuando se acercan a los polos, se someten a un movimiento oscilatorio impulsado por el campo de RF, y colisión con helio a este punto podría calentar los iones en lugar de enfriarlos. Así un potencial plano radial con las paredes más verticales deben facilitar el enfriamiento de colisiones de iones, ya que en este caso, el movimiento oscilatorio y por lo tanto las colisiones calentamiento, se limitará a una pequeña fracción del volumen de la trampa. Las desventajas de utilizar un mayor número de polos es que el iones, repartidas en un mayor volumen que resulta en una densidad de iones de baja en el eje de la trampa, y de acceso óptico a los iones atrapados en la dirección radial es limitado. 2.4. Interrogatorio espectroscópicas Por lo general se inyectan 10.000 iones en la trampa de 22 polos, que tiene un volumen de activos de _5 cm. Dada la densidad de iones de _2_103 cm_3, está claro que cualquier tipo de absorción directa espectroscopia sería difícil si no imposible. Además, esta densidad de iones está en el límite de lo que puede ser detectado por fluorescencia inducida por láser (LIF), un problema que es agravada por la geometría desfavorable de la trampa de iones de 22 polos para la detección de fotones. Necesitamos por lo tanto un medio más sensibles de detección espectroscópica, y para ello se utilizan photofragmentation. Después de la excitación UV de un cromóforo aromático en un péptido protonadas, algunos fracción de los iones fragmento, ya que los rendimientos cuánticos de fluorescencia son rara

vez la unidad. Esto puede ocurrir después de la conversión interna a niveles de vibración muy emocionados de la electrónica del estado fundamental o cruzando a otros estados electrónicos que son disociativos en alguna coordenada. De este modo, el uso masivo resuelto detección de photofragments como sensibles herramienta espectroscópica. Como se muestra esquemáticamente en la figura 2a, medimos los espectros electrónicos de los iones de frío en la trampa mediante la detección de un determinado photofragment carga en función de la longitud de onda UV. Nuestro objetivo final es la medición de los espectros infrarrojos de los iones biomoleculares, ya que tal espectros pueden proporcionar información sobre la conformación de la molécula. El uso de un IR-UV doble sistema de resonancia, se ilustra esquemáticamente en la figura 2b, podemos medir una IR espectro de confórmeros individuales de los iones atrapados. Para ello, despedir a un pulso de infrarrojos de una OPO 200 ns antes del pulso ultravioleta, el agotamiento de la población del estado del suelo cada vez que la frecuencia infrarroja coincide con una transición de vibración de la molécula original. La Transición IR es detectado como un chapuzón en la señal photofragmentation UV como el IR frecuencia se explora a través de una banda vibracional. Para que este método de trabajo, las moléculas promovido a un estado vibracional excitado no debe absorber un fotón láser UV de la misma frecuencia que la de los fragmentos de suelo estatal y producir, y si lo hacen, debe ser con reducción de la eficiencia. Debido a que las moléculas de IR-excitado se caliente el interior, se observa su espectro de absorción UV es mucho más amplia y el pico de absorción en el Longitud de onda de UV se reduce considerablemente, lo que lleva a una caída en el espectro IR. Si bien este enfoque de doble resonancia impone el requisito de que la molécula de interés tienen un cromóforo UV, tiene la gran ventaja de que el espectro UV puede utiliza para seleccionar una conformación particular, ya que a menudo tienen diferentes confórmeros ligeramente espectros UV diferentes que se pueden resolver si las moléculas son internamente frío. Por lo tanto, el IR 486 T. R. Rizzo et al. Descargado por: [Universidad Pablo de Olavide] En: 08:33 09 de enero 2010 spectra that we obtain are those of single conformations of molecule of interest, which greatly facilitates the assignment of the spectra as well as their comparison with the predictions of theory. There is one potential limitation to photofragment-based spectroscopic approaches using UV excitation. In the case where fast internal conversion after UV excitation creates a highly vibrationally excited molecule in the ground electronic state, one expects that the unimolecular dissociation rate will decrease with the increasing size of molecule to the point that it may become comparable to the rate of infrared radiation or collisional deactivation with residual helium in the trap, both of which will compete with dissociation. Thus, we expect that spectroscopic detection by single-photon photofragmentation may become more difficult with increasing molecular size, although it is not clear where this limit will be. In Section 6, we will give an example of how we are overcoming this limitation.

2.5. Computational methods Our computational approach begins with a conformational search using the AMBER force field [77] within the Macromodel package [78]. The procedure generates 50,000 Dissociation threshold Internal conversion

MH+ MH A+ + B +* MH++ Fragment ion signal 37500 37550 37600 37650

UV dissociation wavenumber/cm –1 Scan UV dissociation laser (a) Fix UV dissociation laser Scan IR laser Dissociation threshold Internal conversion

MH+ A+ MH + B +* MH++ Fragment ion signal 3200 3300 3400 3500 3600

IR depletion wavenumber/cm –1

(b) ++

Figure 2. [Colour online] Spectroscopic schemes applied to cold biomolecular ions for measuring (a) electronic spectra of cold biomolecular ions via photofragment detection and (b) conformationspecific infrared spectra by detecting the depletion of the UV-induced photofragment signal.

International Reviews in Physical Chemistry 487 Downloaded By: [Universidad Pablo de Olavide] At: 08:33 9 January 2010

structures in the initial search but retains only those unique conformations under 50 kJ/ mol relative energy. For molecules with one or two amino acids, we re-optimise all of the structures found with Macromodel using Gaussian 03 [79] at the B3LYP/6-31þþG** level of theory [80,81] and carry out harmonic frequency calculations at the same level. Because more than one thousand conformations may be found in the initial search, we first calculate single-point energies of all the structures using Gaussian at the B3LYP/6-31G** level of theory, and use these energies to decide which structures merit full optimisations and frequency calculations using B3LYP/6-31þþG**. In addition, all of the conformations are classified according to the major degrees of freedom (number and type of hydrogen bonds, aromatic ring orientation, etc.), and representative structures of each class are also optimised. The energies we report are zero-point corrected, and harmonic frequencies are scaled by 0.954 for amino acids and 0.952 for helical peptides. 3. Spectroscopy of protonated aromatic amino acids The three aromatic amino acids, tryptophan, tyrosine and phenylalanine, are naturally occurring candidates for probe chromophores, and it is important to understand their spectroscopy and photophysics before using them in more complex molecules. Extensive work has been done on these aromatic amino acids in their neutral form [2,3,31,34, 82–84], but as we are investigating closed-shell ions, one must understand the effect of the charge on the photophysics. At the same time, protonated amino acids are relatively simple systems with which to determine the degree of cooling, and hence residual thermal inhomogeneous broadening, in our cold ion trap. Finally, spectroscopic studies of protonated amino acids can be used to investigate whether IR–UV double resonance can be combined with photofragment-based detection techniques. The amino acid tryptophan has clearly been the chromophore of choice for spectroscopic studies of peptides and proteins in solution since it has a strong UV absorption and relatively high fluorescence quantum yield. Much of the gas-phase work on neutral amino acids and peptides have also focussed on tryptophan as a chromophore in an effort to better understand its behaviour in solution – in particular its nonexponential fluorescence decay [10–12]. Despite its wide use, it is not obvious that tryptophan would be the chromophore of choice for the spectroscopic approach taken here. The requirements for a good probe chromophore for photofragmentation-based techniques represent a balance between competing factors. On the one hand, one needs non-radiative processes to occur in the excited electronic state leading to fragmentation, allowing us to detect the absorption of radiation via the appearance of fragments. Having a high fluorescence quantum yield means that the fraction of molecules in the electronically excited state that fragment will be correspondingly lower and, in this

sense, it might be an advantage to use phenylalanine, with the lowest fluorescence quantum yield, even though it has a lower oscillator strength [85]. On the other hand, if the non-radiative processes are too fast, this will tend to broaden the electronic spectrum and inhibit our ability to resolve individual conformations. Our first goal, then, was to examine the electronic spectra of the protonated amino acids tryptophan, tyrosine and phenylalanine. Given the extensive work done on neutral, gas-phase tryptophan [1–4], we began our studies by examining protonated tryptophan in our cold ion trap. 488 T. R. Rizzo et al. Downloaded By: [Universidad Pablo de Olavide] At: 08:33 9 January 2010

As in all the aromatic amino acids, protonation of the isolated molecule is expected to occur on the amino group, forming an ammonium (NHþ 3 ) on the backbone. This is supported by relatively high level calculations [62] and as demonstrated below, is consistent with the spectrum, which is little shifted from the neutral molecule. One would expect protonation on the aromatic ring to cause a substantial shift of the electronic band origin. Figure 3 shows the photofragment excitation spectrum of TrpHþ in our cold ion trap obtained by collecting the fragment ions at m/z 188 (which corresponds to loss of NH3) as a function of the wavenumber of the UV laser [86]. As a first test of our new spectroscopic approach, these results were at first rather disappointing. While the broad, primary peak in the spectrum is close to that of the neutral molecule, confirming that protonation does not occur on the indole ring, its breadth suggested that the cooling in the ion trap might not be complete. The spectrum is slightly narrower than that measured by Weinkauf in a quadrupole ion trap cooled to liquid nitrogen temperature [62] as well as that measured by Talbot et al. [87] at room temperature, but is far broader than the electronic spectrum of the neutral molecule measured in a supersonic expansion [3]. This initially caused us to question the vibrational temperature of the ions in our 22-pole ion trap and led us to perform a number of diagnostics to verify the degree of cooling. The observation that we could form clusters of protonated amino acids with one or two helium atoms in the trap [68] suggested that the internal temperatures should be on the order of 15 K, assuming the binding energy of helium to a protonated amino acid is similar that that of NHþ 4 _ He [88]. A series of papers by Kang et al. [63, 89–91] helped provide insight into the reasons for the broad TrpHþ spectrum. The authors used femtosecond laser pulses at 266nm to excite protonated tryptophan and tyrosine generated by electrospray but not cooled, and then probed the population of the excited state using an 800nm photon, which can excite the molecule to higher states and change the fragmentation pattern. Their results reveal drastically different excited-state lifetimes for protonated tryptophan and tyrosine. Relative fragment ion signal 35,000 35,500 36,000 36,500 Wavenumber/cm–1 347 cm–1

Figure 3. [Colour online] Electronic photofragment excitation spectrum of cold TrpH þ obtained by collecting the fragment ions at m/z 188 as a function of the UV laser wavenumber. Adapted with permission from [86]. Copyright 2006 American Chemical Society.

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The decay of the _–_* state in TrpHþ exhibits a rapid drop on a timescale of 380 fs followed by a more complicated behaviour at later times. In contrast, protonated tyrosine exhibits a simple exponential decay of 22 ps. The observation of fast excited state decay in protonated tryptophan suggested that the broad spectrum that we observed may not be the result of incomplete cooling in the ion trap but could be inherently limited by the short lifetime of the excited state. While the overall width of the main feature of TrpHþ (347 cm_1) would imply a much shorter lifetime than that measured by Kang et al. [63], it is likely that the spectrum contains contributions from a few stable conformers that may exhibit low frequency vibrational progressions as in the case of the neutral molecule [3]. If each spectral feature were broadened by 13 cm _1, as implied by the 380 fs lifetime measured by Kang et al. [63], it could give rise to a broad feature with an overall width on the order of what we observe. Moreover, one should note that the lifetimes determined by Kang et al. are upper limits – they cannot rule out even faster excited-state decay. Thus, our ability to form weakly bound helium clusters [68], together with the time-resolved data of Kang et al. [63], suggests that the broad feature in the electronic spectrum of TrpH þ is

not the result of incomplete cooling but results in large measure from lifetime broadening. If this were the case, then one would expect that spectral features of the other protonated amino acids should be significantly narrower than that of TrpHþ. Figures 4 and 5 show electronic spectra of TyrH þ and PheHþ cooled in our 22-pole ion trap [68], both of which exhibit resolved vibronic features that reflect a significantly longer lifetime than that of protonated tryptophan, consistent with the time-resolved work of Kang et al. [63]. These well-resolved spectra can be used as a diagnostic for the internal temperatures of the molecules in our ion trap, demonstrated here for the case of PheHþ. As will be shown below, the two most prominent features in the spectrum, which occur at 37,530 cm_1 and 37,541 cm_1, correspond to the electronic band origins of two stable conformations of the molecule, and we label these band origins A0 0 and B00 respectively. The inset of Figure 5 shows a blow-up of the region of the spectrum to the red of these Relative fragment ion signal 35,050 35,100 35,150 35,200 35,250 35,300 35,350 2.7 cm–1 A0 0

B0 C0 0

D0 0

Wavenumber (cm–1)

Figure 4. [Colour online] Electronic photofragment excitation spectrum of cold TyrH þ recorded by detecting the fragment at m/z 136. The labels A0 0–D0 0 indicate the electronic band origins of four distinct conformers.Adapted with permission from [86]. Copyright 2006 American Chemical Society.

490 T. R. Rizzo et al. Downloaded By: [Universidad Pablo de Olavide] At: 08:33 9 January 2010

band origins where one would expect hot-bands of low-frequency vibrational modes to occur. One can see two features separated from A0 0 and B0 0 by approximately _43 cm _1, which is almost identical to the spacing of the first two small peaks to the high frequency side of the band origins. This suggests that protonated phenylalanine has a low frequency mode of _43 cm_1 in both the ground and excited electronic state. The intensity of the hot bands relative to the band origins gives us an estimate of the vibrational temperature of the molecule, although this requires us to assume a particular oscillator strength for the hotband transitions. If we assume that the band strength of the hot-bands, X0 1, is similar to that of its corresponding vibronic band X1 0, we arrive at a vibrational temperature between 11 and 16 K. This is consistent with the rotational temperature determined from a rough simulation of the band contours. While this might not seem particularly cold, at these internal temperatures the populations of even the lowest frequency vibrational modes do not contribute to spectral congestion in a significant way. With well-resolved electronic spectra such as those of Figures 4 and 5, we can use IR–UV double resonance to further identify features corresponding to different stable conformations of the parent molecule by measuring an IR spectrum of each conformer. Figure 6 shows IR–UV double-resonance spectra of PheHþ with the UV laser set on one of the two band origins, A0 0 or B00 , in Figure 5. It is evident that these IR spectra are different, confirming that the two features in the electronic spectrum correspond to different stable conformations of the molecule. Even before measuring an IR spectrum, the electronic spectrum of PheHþ suggests the presence of at least two stable conformers. The observation of two strong features near the band origin spaced by 10.6 cm _1 without a further progression of peaks at roughly the same spacing suggests that these two features are not members of a Franck–Condon progression, since by their very nature such progressions rarely terminate abruptly. Calculated spectra and the corresponding structures for the two lowest-energy conformers of protonated phenylalanine are also Relative fragment ion signal

37,500 37,550 37,600 37,650 37,700 Wavenumber (cm–1) x100 41.6 cm–1 43.7 cm–1 42.9 cm–1 43.6 cm–1

A0 0

B0 0

Figure 5. [Colour online] Electronic photofragment excitation spectrum of cold PheHþ recorded by detecting the fragment at m/z 74. The labels A0 0 and B0 0 indicate the electronic band origins of two distinct conformers. To the low energy side of these band origins, a blow up of the spectrum shows two low frequency hot bands that help determine the vibrational temperature.

International Reviews in Physical Chemistry 491 Downloaded By: [Universidad Pablo de Olavide] At: 08:33 9 January 2010

shown in Figure 6. While the calculations do not reproduce the IR spectra exactly, they recover the important qualitative features – two of the ammonium NH stretches are strongly shifted to the red, one by interaction with the benzene ring and the other through interaction with the backbone carbonyl, while the third NH stretch is relatively unperturbed. The calculated structures differ primarily by a rotation of the side-chain about the C_–C_ bond. A similar treatment of TyrHþ reveals four rather than two conformers and a correspondingly more complex electronic spectrum. The doubling of the number of conformers in TyrHþ comes from the two possible positions of the phenol OH, which differ in energy by about 120 cm _1. Before moving on to larger peptides containing one of these chromophores, it is worth returning to the question of protonated tryptophan. The work of Kang et al. [89] identified the reason for the fast decay from the excited electronic state compared to PheH þ and TyrHþ – it comes from a low crossing barrier from the _–_* state to a _–_* state that is dissociative in the NH coordinate. The difference between TrpHþ in the gas phase and tryptophan in solution is nevertheless curious, in that the latter has a significant fluorescence quantum yield, implying a substantially longer lifetime. One usually expects that excited-state lifetimes will be longer in the isolated molecule compared to solution because the possibility of quenching by the solvent is removed. We investigated this difference by producing complexes of TrpHþ with water in the gas phase to observe the effect of solvent in a stepwise manner [64]. Figure 7 shows the primary band in the electronic spectrum of bare protonated tryptophan together with that of the singly- and doubly-solvated species. One can clearly see a narrowing of the main band even with the addition of a single water molecule. Upon complexation with a second water molecule, the spectral features become as narrow as those of PheHþ and TyrHþ, implying a change in lifetime of up to two orders of magnitude. As has been described in detail, this dramatic 3000 3100 3200 3300 3400 3500 3600 Wavenumber (cm–1) A0 0

B0 0

Figure 6. [Colour online] Infrared spectra of two conformers of cold of PheH þ obtained with the UV laser set on the band origins A0 0 and B0 0 in the electronic spectrum of Figure 5. Calculated spectra (B3LYP/6-31þþG**) are shown below the experimental spectra. The structures shown are those derived from the corresponding calculation. Adapted with permission from [67]. Copyright 2006 American Chemical Society.

492 T. R. Rizzo et al. Downloaded By: [Universidad Pablo de Olavide] At: 08:33 9 January 2010

change comes from shifting the _–_* state relative to the _–_* state upon solvation [64]. While the short excited state lifetime is caused by the charge on the ammonium, we have shown that it does not depend upon the charge being close to the chromophore in terms of the number of bonds, but rather by its proximity in space. This may have important implications for studies using tryptophan as a spectroscopic probe in solution when the indole ring is close to a charged group [92]. From the point of view of the development of the experimental technique, the conclusions that we can draw from these studies of protonated, aromatic amino acids are

as follows: . It is possible to cool electrosprayed ions in a 22-pole ion trap to between 11 and 16 K, which is low enough that low-frequency vibrational bands are not populated. This essentially eliminates vibrational hot-bands from the spectra. . There is a fast decay of the indole chromophore of tryptophan in the presence of a charge. This suggests that tyrosine or phenylalanine might be better suited as spectroscopic probes of charged, gas-phase peptides. . IR–UV double-resonance can be combined with photofragment spectroscopy to measure conformation-specific IR spectra. We now describe the application of the same techniques to larger, more complex molecules. 34,800 35,000 35,200 35,400 Wavenumber (cm–1) Wavenumber (cm–1) Wavenumber (cm–1) 35,150 35,200 35,250 35,300 34,800 35,000 35,200 35,400

(a) TrpH+ (b) TrpH+(H2O)1 (c) TrpH+(H2O)2 Figure 7. [Colour online] Electronic photofragment excitation spectra of TrpH þ with 0, 1 and 2 attached water molecules. Reprinted with permission from [64]. Copyright 2006 American Chemical Society.

International Reviews in Physical Chemistry 493 Downloaded By: [Universidad Pablo de Olavide] At: 08:33 9 January 2010

espectros que se obtienen son los de la conformación de una sola molécula de interés, que facilita en gran medida la asignación de los espectros, así como su comparación con los predicciones de la teoría. Hay una limitación potencial de photofragment enfoques basados en espectroscopia con excitación UV. En el caso de que la conversión rápida interna después de la excitación UV crea una molécula altamente vibracionalmente excitados en el estado fundamental, se espera que el unimolecular tasa de disociación disminuye con el aumento del tamaño de la molécula a la punto que puede llegar a ser comparable a la tasa de radiación infrarroja o colisión desactivación con helio residual en la trampa, los cuales van a competir con la disociación. Por lo tanto, esperamos que la detección espectroscópica de un solo fotón puede photofragmentation cada vez más difícil con el aumento de tamaño molecular, aunque no está claro donde esta límite será. En la Sección 6, vamos a dar un ejemplo de cómo estamos superando esta limitación. 2.5. Métodos de cálculo Nuestro método de cálculo comienza con una búsqueda de la conformación con el AMBER campo de fuerza [77] dentro del paquete macromodelo [78]. El procedimiento genera 50.000 La disociación del umbral Interno conversión MH + MH A + + B + * MH + + Fragmento de la señal de iones 37500 37550 37600 37650 UV disociación wavenumber/cm-1 Escaneo láser UV disociación (A) Fix UV disociación láser Escaneo láser IR La disociación del umbral

Interno conversión MH + A + B + MH MH + * + + Fragmento de la señal de iones 3200 3300 3400 3500 3600 IR agotamiento del número de onda / cm -1 (B) ++ Figura 2. [Color en línea] espectroscópicas aplicadas a planes de iones biomoleculares frío para medir (a) espectros electrónicos de iones biomoleculares frío a través de la detección y photofragment conformationspecific (b) espectros infrarrojos mediante la detección de la disminución de la señal de photofragment inducidos por UV. Comentarios internacional en Física 487 Química Descargado por: [Universidad Pablo de Olavide] En: 08:33 09 de enero 2010 estructuras en la búsqueda inicial, pero conserva sólo las conformaciones únicas de menos de 50 kJ / mol relativos de la energía. Para moléculas con uno o dos aminoácidos, que volverá a optimizar todos los estructuras que se encuentran con macromodelo utilizando Gauss 03 [79] en el nivel B3LYP/631þþG ** de la teoría [80,81] y llevar a cabo los cálculos de armónicos de frecuencia en el mismo nivel. Porque más de un millar de conformaciones se puede encontrar en la búsqueda inicial, en primer lugar calcular un solo punto las energías de todas las estructuras con Gauss en el B3LYP/6-31G ** nivel de la teoría, y el uso de estas energías para decidir qué estructuras mérito optimización completa y los cálculos de frecuencia usando B3LYP/6-31þþG **. Además, todas las conformaciones se clasifican de acuerdo a los grados mayores de libertad (número y tipo de enlaces de hidrógeno, la orientación de anillos aromáticos, etc), y las estructuras representativas de cada clase también están optimizados. Las energías que se informe de punto cero corregido y armónica frecuencias se ajustan en 0.954 de los aminoácidos y péptidos de 0.952 helicoidal. 3. Espectroscopia de protonadas aminoácidos aromáticos Los tres aminoácidos aromáticos, triptófano, tirosina y fenilalanina, son, naturalmente, ocurren los candidatos a los cromóforos de la sonda, y es importante para entender su espectroscopia y fotofísica antes de usarlos en moléculas más complejas. Extenso trabajo se ha hecho en estos aminoácidos aromáticos en su forma neutral [2,3,31,34, 82-84], pero como estamos investigando con cáscara cerrada iones, uno debe entender el efecto de la carga en el fotofísica. Al mismo tiempo, protonadas aminoácidos son relativamente simples sistemas que permitan determinar el grado de enfriamiento, y por lo tanto térmica residual homogénea posible ampliación, en nuestra trampa de iones frío. Finalmente, los estudios espectroscópicos de protonadas aminoácidos se pueden utilizar para investigar si IR-UV de doble resonancia puede combinarse con técnicas de detección basadas en photofragment. El aminoácido triptófano ha sido claramente el cromóforo de elección para Los estudios espectroscópicos de péptidos y proteínas en solución, ya que tiene un fuerte UV

absorción y rendimiento de fluorescencia relativamente alto cuántica. Gran parte del trabajo en fase gaseosa neutral en aminoácidos y péptidos también se centró en triptófano como un cromóforo en un esfuerzo por entender mejor su comportamiento en la solución - en particular, su nonexponential decaimiento de fluorescencia [10-12]. A pesar de su amplio uso, no es obvio que triptófano sería el cromóforo de elección para el enfoque espectroscópicas tomadas aquí. Los requisitos para un cromóforo sonda bueno para photofragmentation basado en técnicas representan un equilibrio entre los factores de la competencia. Por un lado, se necesita no radiativa los procesos que se produzcan en el estado electrónico excitado que conduce a la fragmentación, lo que nos permite detectar la absorción de la radiación a través de la aparición de fragmentos. Después de haber un alto rendimiento cuántico de fluorescencia significa que la fracción de moléculas en el estado electrónicamente excitado ese fragmento será proporcionalmente inferior y, en este sentido, podría ser una ventaja para el uso de fenilalanina, con el menor fluorescencia rendimiento cuántico, a pesar de que tiene una fuerza de oscilador de baja [85]. Por otro lado, si el no radiativa procesos son demasiado rápidos, lo que tenderá a ampliar el espectro electrónico y inhiben nuestra capacidad para resolver conformaciones individuales. Nuestro primer objetivo era, pues, a examinar los espectros electrónicos de los aminoácidos protonadas triptófano, tirosina y fenilalanina. Dado el amplio trabajo realizado en el neutro, en fase gaseosa triptófano [1-4], comenzamos nuestros estudios mediante el examen de triptófano protonadas en la trampa de iones frío. 488 T. R. Rizzo et al. Descargado por: [Universidad Pablo de Olavide] En: 08:33 09 de enero 2010 Como en todos los aminoácidos aromáticos, la protonación de la molécula aislada se espera que ocurren en el grupo amino, formando una de amonio (NHþ 3) en la columna vertebral. Es con el apoyo de los cálculos de nivel relativamente alto [62] y como se demuestra a continuación, se consistente con el espectro, que es un poco pasado de la molécula neutra. Uno Esperamos protonación en el anillo aromático para causar un cambio sustancial de la banda electrónica origen. La Figura 3 muestra el espectro de excitación photofragment de TrpHþ en nuestra trampa de iones frío obtenida por la recogida de los fragmentos de iones de m / z 188 (que corresponde a la pérdida de NH3), como en función del número de onda del láser UV [86]. Como primera prueba de nuestro nuevo espectroscópicas enfoque, los resultados fueron al principio más bien decepcionante. Mientras que el pico ancho, en primaria el espectro es similar a la de la molécula neutra, lo que confirma que la protonación no se producen en el anillo de indol, su amplitud sugirió que el enfriamiento en la trampa de iones podría no ser completa. El espectro es ligeramente más estrecho que el medido por Weinkauf en un cuadrupolo de trampa de iones se enfría a temperatura de nitrógeno líquido [62], así como la

medida por Talbot et al. [87] a temperatura ambiente, pero es mucho más amplio que el espectro electrónico de la molécula neutra se mide en una expansión supersónica [3]. Este principio nos hizo cuestión de la temperatura de vibración de los iones en la trampa de iones de 22 polos y nos llevó a realizar una serie de pruebas para verificar el grado de enfriamiento. La observación de que nos podrían formar grupos de protonadas aminoácidos con uno o dos átomos de helio en la trampa [68] sugiere que la temperatura interna debe ser del orden de 15 K, suponiendo que el energía de enlace de helio a un ácido amino protonado es similar que la de NHþ 4 _ El [88]. Una serie de documentos por Kang et al. [63, 89-91] ayudó a dar una idea de las razones por las el espectro TrpHþ amplio. Los autores usaron pulsos de láser de femtosegundo en 266 nm para excitar triptófano y la tirosina protonadas generada por electrospray, pero no se enfría, y luego probaron la población del estado excitado con un fotón de 800 nm, lo que puede excitar a los molécula a estados superiores y cambiar el patrón de fragmentación. Sus resultados revelan drásticamente diferente en estado excitado vida para el triptófano y la tirosina protonada. Fragmento de señal relativa de iones 35.000 35.500 36.000 36.500 Wavenumber/cm-1 347 cm-1 Figura 3. [En línea Color] espectro electrónico de excitación photofragment de frío TrpHþ obtenidos por recoger los fragmentos de iones de m / z 188 en función del número de onda láser UV. Adaptado con permiso de [86]. Copyright 2006 Sociedad Americana de Química. Comentarios Internacional de Química Física 489 Descargado por: [Universidad Pablo de Olavide] En: 08:33 09 de enero 2010 La decadencia de la _-_ * Estado en TrpHþ exhibe una rápida caída en un plazo de 380 fs seguido por un comportamiento más complicado en los últimos tiempos. Por el contrario, la tirosina protonadas muestra un decaimiento exponencial simple de 22 ps. La observación de la descomposición rápida en estado excitado triptófano protonadas sugirió que el amplio espectro que hemos observado no puede ser el resultado del enfriamiento incompleta en la trampa de iones, pero podría ser inherentemente limitada por el corto tiempo de vida del estado excitado. Mientras que el ancho total de la característica principal de TrpHþ (347 cm_1) implicaría una vida útil mucho más corta que la medida por Kang et al. [63], que Es probable que el espectro contiene contribuciones de algunos conformistas estable que puede presentan las progresiones de baja frecuencia vibratoria como en el caso de la molécula neutra [3]. Si cada característica espectral se ampliaron en un 13 cm_1, como se deduce de la vida fs 380 medida por Kang et al. [63], podría dar lugar a una característica general con una anchura total de el orden de lo que observamos. Por otra parte, cabe señalar que el tiempo de vida determinado por

Kang et al. son los límites superiores - que no se puede descartar aún más rápido en estado excitado decadencia. Por lo tanto, nuestra capacidad para formar grupos débilmente helio [68], junto con los datos de tiempo resuelto de Kang et al. [63], sugiere que la función amplia en el espectro electrónico de TrpHþ es no el resultado del enfriamiento incompleto, pero la ampliación de los resultados en gran medida de toda la vida. Si este fuera el caso, entonces uno podría esperar que las características espectrales de los otros protonadas aminoácidos debe ser significativamente menor que el de TrpHþ. Las figuras 4 y 5 muestran los espectros electrónicos de TyrHþ y PheHþ enfría en nuestros 22 polos de iones trampa [68], los cuales presentan características resuelto vibronic que reflejan una significativamente mayor vida que la de triptófano protonadas, de conformidad con la resolución temporal de trabajo Kang et al. [63]. Estos espectros bien resueltos se puede utilizar como un diagnóstico para el mercado interior temperaturas de las moléculas en nuestra trampa de iones, ha demostrado aquí en el caso de PheHþ. Como se verá más adelante, las dos características más importantes en el espectro, que se producen en 37.530 y 37.541 cm_1 cm_1, corresponden a los orígenes de la banda electrónica de dos estables conformaciones de la molécula, y la etiqueta de estos orígenes banda A0 0 y B00 , respectivamente. El recuadro de la Figura 5 se muestra un blow-up de la región del espectro hacia el rojo de estos Fragmento de señal relativa de iones 35.050 35.100 35.150 35.200 35.250 35.300 35.350 2,7 cm-1 A0 0 B0 C0 0 D0 0 Número de onda (cm-1) Figura 4. [En línea Color] espectro electrónico de excitación photofragment de frío TyrHþ registrados por detectar el fragmento de m / z 136. Las etiquetas A0 0-D0 0 indican los orígenes de la banda electrónica de cuatro distintas conformers.Adapted con permiso de [86]. Copyright 2006 Sociedad Americana de Química. 490 T. R. Rizzo et al. Descargado por: [Universidad Pablo de Olavide] En: 08:33 09 de enero 2010 orígenes la banda donde se podría esperar en caliente bandas de baja frecuencia para los modos de vibración ocurrir. Uno puede ver dos características separadas de A0 0 y B0

0 en aproximadamente _43 cm_1, que es casi idéntica a la separación de los dos primeros picos pequeños a la alta frecuencia lado de los orígenes de la banda. Esto sugiere que la fenilalanina protonadas tiene una frecuencia baja modo de _43 cm_1 tanto en el suelo y el estado electrónico excitado. La intensidad del calor bandas en relación con los orígenes de banda nos da una estimación de la temperatura de vibración de la molécula, aunque esto nos obliga a asumir una fuerza particular para el oscilador hotband transiciones. Si asumimos que la fuerza de la banda de las bandas en caliente, X0 1, es similar a la de su correspondiente banda X1 vibronic 0, se llega a una temperatura de vibración entre 11 y 16 K. Esto es consistente con la temperatura de rotación determina a partir de un duro simulación de los contornos de la banda. Aunque esto puede no parecer particularmente frío, en estos la temperatura interna de las poblaciones de incluso los modos de menor frecuencia de vibración se no contribuyen a la congestión del espectro de una manera significativa. Con los espectros bien resueltos electrónicos, tales como las de las figuras 4 y 5, se puede utilizar IR-UV de doble resonancia para determinar con más precisión las características correspondientes a las distintas estable conformaciones de la molécula mediante la medición de un espectro IR de cada conformación. La figura 6 muestra IR-UV de doble resonancia espectros de PheHþ con el láser UV encuentra en una de los dos orígenes de la banda, A0 0 o B00 , En la Figura 5. Es evidente que estos espectros IR se diferentes, lo que confirma que las dos características en el espectro electrónico corresponden a diferentes conformaciones estables de la molécula. Incluso antes de la medición de un espectro de IR, el espectro electrónico de PheHþ sugiere la presencia de al menos dos confórmeros estables. La observación de dos características fuertes cerca de la banda de origen separados por 10,6 cm_1 sin progresión de los picos en aproximadamente la misma distancia sugiere que estas dos características que no son miembros de una progresión de Franck-Condon, ya que por su naturaleza, muy progresiones rara vez terminado abruptamente. Espectros calculados y la correspondiente estructuras de los dos confórmeros de menor energía de la fenilalanina protonadas también Fragmento de señal relativa de iones 37.500 37.550 37.600 37.650 37.700 Número de onda (cm-1) x100 41,6 cm-1 43,7 cm-1 42,9 cm-1 43,6 cm-1 A0 0 B0 0

Figura 5. [En línea Color] espectro electrónico de excitación photofragment de frío PheHþ registrados por detectar el fragmento de m / z 74. Las etiquetas A0 0 y B0 0 indican los orígenes de la banda electrónica de dos confórmeros distintos. Para el lado de baja energía de estos orígenes la banda, un golpe arriba del espectro muestra dos bandas de frecuencia baja caliente que ayudan a determinar la temperatura de vibración. Comentarios Internacional de Química Física 491 Descargado por: [Universidad Pablo de Olavide] En: 08:33 09 de enero 2010 muestra en la Figura 6. Mientras que los cálculos no se reproducen los espectros IR exactamente, recuperar las características cualitativas importantes - dos de los tramos de amonio NH fuertemente desplazado hacia el rojo, uno por la interacción con el anillo de benceno y la otra a través de interacción con el carbonilo columna vertebral, mientras que el tercer tramo de NH es relativamente imperturbable. Las estructuras calculadas difieren principalmente por una rotación de la cadena lateral sobre el vínculo C_-C_. Un tratamiento similar de TyrHþ revela cuatro en lugar de dos confórmeros y un espectro electrónico correspondientemente más complejas. La duplicación del número de confórmeros en TyrHþ proviene de las dos posiciones posibles de la OH fenol, que difieren en la energía de unos 120 cm_1. Antes de pasar a los grandes péptidos que contienen uno de estos cromóforos, vale la pena Volviendo a la pregunta de triptófano protonada. La obra de Kang et al. [89] identificó la razón de la descomposición rápida del estado electrónico excitado en comparación con PheHþ y TyrHþ - se trata de una barrera de baja cruce de la _-_ * Estado a una _-_ * estado que se disociativos en la coordinación de NH. La diferencia entre TrpHþ en la fase gaseosa y triptófano en la solución es, sin embargo curioso, en que este último tiene un impacto significativo rendimiento cuántico de fluorescencia, lo que implica una vida mucho más tiempo. Por lo general se espera que que en estado excitado vida será más larga de la molécula aislada en comparación con solución porque la posibilidad de extinción por el disolvente se ha eliminado. Hemos investigado esta diferencia mediante la producción de los complejos de TrpHþ con agua en la fase gaseosa para observar el efecto del disolvente en una forma gradual [64]. La figura 7 muestra la banda principal en el espectro electrónico de triptófano protonadas desnudo junto a la de los mono-y doblemente solvatados especies. Uno puede ver claramente un estrechamiento de la banda principal, incluso con la Además de una sola molécula de agua. Tras la formación de complejos con una molécula de agua en segundo lugar, la características espectrales a ser tan estrechas como las de PheHþ y TyrHþ, lo que implica un cambio en la vida útil de hasta dos órdenes de magnitud. Como se ha descrito en detalle, esta espectacular 3000 3100 3200 3300 3400 3500 3600 Número de onda (cm-1) A0 0

B0 0 Figura 6. [Color en línea] infrarrojos espectros de dos confórmeros de frío de PheHþ obtenidos con el Láser UV conjunto sobre los orígenes de banda A0 0 y B0 0 en el espectro electrónico de la figura 5. Espectros calculados (B3LYP/6-31þþG **) A continuación se muestran los espectros experimentales. Las estructuras se muestran son las derivados de los cálculos correspondientes. Adaptado con permiso de [67]. Copyright 2006 American Chemical Society. 492 T. R. Rizzo et al. Descargado por: [Universidad Pablo de Olavide] En: 08:33 09 de enero 2010 el cambio viene de cambiar el _-_ * Estado en relación con el _-_ * en estado de solvatación [64]. Mientras que el corto tiempo de vida del estado excitado es causada por la carga de amonio, hemos demostrado que no depende de la carga de estar cerca de los cromóforos en términos de el número de enlaces, sino más bien por su proximidad en el espacio. Esto puede tener importantes implicaciones para los estudios de uso de triptófano como sonda espectroscópica en una solución cuando el anillo de indol está cerca de un grupo encargado de [92]. Desde el punto de vista del desarrollo de la técnica experimental, la conclusiones que podemos extraer de estos estudios de los ácidos protonados, aminoácidos aromáticos son de la siguiente manera: . Es posible enfriar los iones electrosprayed en una trampa de iones de 22 polos de entre 11 y 16 K, que es suficientemente bajo para que las bandas de baja frecuencia de vibración no son pobladas. Esto esencialmente elimina la vibración en caliente las bandas de los espectros. . Hay un decaimiento rápido del cromóforo indol de triptófano en la presencia de un de carga. Esto sugiere que la tirosina o fenilalanina podría ser más adecuada como sondas espectroscópicas de carga, en fase gaseosa péptidos. . IR-UV de doble resonancia puede ser combinada con la espectrometría de photofragment medida de la conformación específica de los espectros IR. Ahora describir la aplicación de las mismas técnicas para grandes, más complejos moléculas. 34.800 35.000 35.200 35.400 Número de onda (cm-1) Número de onda (cm-1) Número de onda (cm-1) 35.150 35.200 35.250 35.300 34.800 35.000 35.200 35.400 (A) TrpH + (B) TrpH + (H2O) 1 (C) TrpH + (H2O) 2 Figura 7. [Color en línea] electrónica photofragment espectros de excitación de TrpHþ con 0, 1 y2 las moléculas de agua adjunto. Reproducido con permiso del [64]. Copyright 2006 American Chemical La sociedad.

Comentarios Internacional de Química Física 493 Descargado por: [Universidad Pablo de Olavide] En: 08:33 09 de enero 2010 4. The scaling of spectral complexity with increasing molecular size The electronic spectra of the protonated amino acids TyrHþ and PheHþ, while complex compared to those of small molecules typically studied by gas-phase spectroscopy, are still rather simple in that the region near the vibronic band origin is well-resolved, allowing the selection of individual conformers for measuring conformer-specific IR spectra. If one applies these techniques to molecules of increasing size, the question arises as to whether the electronic spectra will be too complex to resolve individual features. Consider the factors that could potentially contribute to the complexity of the electronic spectrum of a large molecule: (1) thermal inhomogeneous broadening; (2) spectral broadening from short excited state lifetimes; (3) a large number of Franck–Condon active low-frequency vibrations; (4) conformational heterogeneity. We have demonstrated that for protonated amino acids we can eliminate thermal inhomogeneous broadening through collisions with cold helium in an ion trap and that the cooling process is complete within the first 5–7 ms, after which the spectra no longer change [68]. Given that a significant number of cooling collisions continue to occur over the first 30–40 ms, it seems that the trap still has considerable unused cooling capacity. Moreover, while larger molecules contain more internal energy, the collision cross section (and hence the collision rate) with cold helium in the trap also increases, as does the number of low frequency modes through which it is easy to lose vibrational energy. Thus for fixed helium density the ultimate temperature achieved should only increase slowly with increasing molecular size. The second factor is related the specific dynamics of the probe chromophore. We have shown that the indole chromophore of tryptophan exhibits fast excited-state decay and broadened spectra when in proximity to a charged group. While this will remain a problem, we can simply choose to use other chromophores, such as tyrosine or phenylalanine, when this factor becomes limiting. The third factor may be an important one. The number of vibrational modes increases rapidly with the number of amino acid residues in a peptide. The question that we need to address is how many of these modes will have strong Franck–Condon activity, particularly those of low frequency that could give rise to vibrational progressions near the band origin that will prevent the resolution of individual conformers. There is some reason to believe that not all modes will appear in the spectrum. The vibrational modes that have strong Franck–Condon factors will be those for which the bond lengths and angles associated with the vibrational motion change in geometry upon excitation to the excited electronic state. Because we are using the aromatic side chains of amino acids as chromophores, one expects that most of the change in electron density in the excited state will be centred around these chromophores, and thus those bond lengths and angles near to or associated with the aromatic moiety are the ones most likely to change. Thus vibrational modes involving coordinates remote from the chromophore are unlikely to „feel‟ the change in electronic excitation and hence may not appear as a vibrational progression in the electronic spectrum. The last factor that one has to consider is conformational heterogeneity – that is, the fact that as molecules become larger the number of possible stable 494 T. R. Rizzo et al. Downloaded By: [Universidad Pablo de Olavide] At: 08:33 9 January 2010

conformations increases. As we cool molecules and freeze out different conformations in our ion trap, the electronic spectrum of the molecule may be extremely congested, since the precise frequency of the vibronic band origin depends upon the conformation. There is little we can argue on this point in terms of a priori expectations – we are simply left to try the experiment and observe the degree of complexity. Ultimately we can reduce the number of stable conformations in our ion trap by pre-selecting the ions according to their mobility in a helium buffer gas before we trap them. This work is currently being pursued in our laboratory. To test the degree of spectral complexity in a series of molecules of increasing size, we chose peptides containing a single tyrosine chromophore and increasing numbers of alanine residues. The electronic spectra of this series of molecules are shown in Figure 8.

As one can see from this progression, although the number of vibrational modes of the molecules increases by more than a factor of three, the electronic spectrum does not become significantly more complex, and the vibrational band origin seems to remain well resolved. We can draw several conclusions from this simple series of spectra, although one must be careful about generalising them. First, while there is increasing complexity with increasing size, it seems in this case not to be monotonic, and the number of Franck– Condon active vibrational modes does not seem to track the total number of vibrational modes directly. Second, the fact that the band origin remains well resolved seems to reflect the lack of extremely low frequency modes that couple to the electronic transition. While such modes certainly exist, they would have to involve the overall motion of the peptide backbone in such a way as to change the interaction with the chromophore upon vibration. The relative sparsity of the spectrum in the first 20 cm _1 after the electronic band origin may simply mean that the lowest frequency modes do not couple to the chromophore. Finally, the simplicity of the spectrum near the band origin also implies that there are not large numbers of different stable conformers present in the ion trap. While infrared spectra of TyrHþ revealed that four conformers contributed to the electronic spectrum [67], the electronic spectrum of HþAlaTyr appears simpler, and we believe that this is due to a reduced number of stable conformations [66]. Because the molecule is more flexible, the protonated ammonium group can more easily be in contact with the aromatic ring of the tyrosine and maximise this stabilising interaction. A conformer-selected infrared spectrum of this dipeptide is shown in Figure 9, together with a calculated spectrum and the conformation giving rise to it. The close proximity of the ammonium group to the aromatic ring, which is not possible in the bare amino acid, verifies the importance of the cation–_ interaction in stabilising certain conformations. Even for the larger members of this series, the band origin does not seem to be overly congested by the presence of a large number of conformers. Whether this behaviour can be generalised to molecules of even larger size remains to be seen, but the results presented above suggests that our spectroscopic techniques can be applied to molecules at least the size of pentapeptides. 5. Spectroscopy of helical peptides Having demonstrated that our experimental approach can generate well-resolved electronic and vibrational spectra of small peptides, we now show the results of International Reviews in Physical Chemistry 495 Downloaded By: [Universidad Pablo de Olavide] At: 08:33 9 January 2010

applying the same techniques to a series of molecules that we expect to be helical in the gas phase [65,69,93]. The goal of this study was to identify spectroscopic signatures of helices and to test the ability of theory to predict them. The basis of this work comes from the ion mobility studies of Jarrold et al. [94,95], who examined a series of alanine-containing peptides, Ac-(Ala)n-LysHþ, Ac-LysHþ-(Ala)n, 35,050 35,100 35,150 35,200 35,250 Wavenumber (cm–1) 34,500 34,550 34,600 34,650 34,700 Wavenumber (cm–1) 35,850 35,900 35,950 36,000 36,050 Wavenumber (cm–1) 35,050 35,100 35,150 35,200 35,250 Wavenumber (cm–1)

(a) TyrH+ (b) H+AlaTyr (c) H+AlaAlaTyr (d) H+AlaAlaTyrAlaAla

Figure 8. [Colour online] Electronic photofragment excitation spectra of a series of tyrosinecontaining peptides; (a) TyrHþ; (b) HþAlaTyr; (c) HþAlaAlaTyr; (d) HþAlaAlaTyrAlaAla.

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and (Ala)nHþ, as a function of the number of alanine residues, n. By measuring the relative drift times through helium, they determine the average cross section of each of these species, and in comparison with molecular dynamics calculations they can detect the difference between helical and non-helical structures. With the N-terminus protected they find that helix formation occurs only when the lysine is at the C-terminus. Putting it at the N-terminus or eliminating it altogether gives rise to non-helical structures. The protonated side-chain of the lysine plays two roles: it is involved in hydrogen bonding with three carbonyl groups on the backbone in such a way as to induce helix formation, and it stabilises the helical structure through a favourable electrostatic interaction with the helix

macro-dipole. For us to measure conformer-specific IR spectra of these alanine-based peptides we need to introduce a UV chromophore in a way that does not interfere with the formation of secondary structure, and we do this by substituting a phenylalanine for the N-terminal alanine reside. Figure 10 shows the electronic spectrum of two such peptides with lysine at the C-terminus: Ac-Phe-(Ala)5-LysHþ and Ac-Phe-(Ala)10-LysHþ, which according to the ion mobility studies should form a helix [95], and one with lysine at the N-terminus, Ac-LysHþ-Phe-(Ala)10, which should not form a helix. The first thing to notice is the relative simplicity of the UV spectra in all cases. Despite the fact that these are larger than the tyrosine-containing peptides shown in Figure 8, the electronic spectra seem, if anything, even simpler. It is clear that at most a small fraction of the low-frequency vibrational modes carry strong Franck–Condon activity. Figure 11 shows conformer-specific infrared spectra obtained by setting the UV laser at a particular band in the electronic spectrum and detecting the dips while scanning the IR OPO. The spectra of Figure 11a and b result from monitoring the two major features, 3000 3200 3400 3600 0 10 20 30 Wavenumber (cm–1) Percent depletion Phenol OH amide NH ‘Free’ ammonium NH ‘Bound’ ammonium NH Caboxyllic acid OH

Figure 9. [Colour online] Conformer-specific IR spectrum of HþAlaTyr recorded with the UV laser set to the electronic band origin at 34525.2 cm _1 together with the calculated spectrum (B3LYP/ 6-31þþG**) and corresponding molecular structure for the lowest energy conformer.

International Reviews in Physical Chemistry 497 Downloaded By: [Universidad Pablo de Olavide] At: 08:33 9 January 2010

marked A and B in Figure 10a, for Ac-Phe-(Ala)5-LysHþ; Figure 11c is recorded with the UV laser frequency fixed on peak A in Figure 10b for Ac-Phe-(Ala)10-LysHþ, and Figure 11d is obtained with the UV frequency set on the major peak in the spectrum of Ac-LysHþ-Phe-(Ala)10 shown in Figure 10c. There are several important features to notice in the infrared spectra of Figure 11a and b. First, the simple fact that these spectra are different indicates that the features in the electronic spectra used to obtain them correspond to different stable conformers. One can thus distinguish conformers relatively easily using such IR spectra, even in molecules of this size. Fragment depletion 3200 3300 3400 3500 3600 Wavenumber (cm–1) (b) (a) (c) (d)

Figure 11. [Colour online] Infrared spectra of (a) conformer A of Ac-Phe-(Ala)5-Lys-Hþ, (b) conformer B of Ac-Phe-(Ala)5-Lys-Hþ, (c) conformer A of Ac-Phe-(Ala)10-Lys-Hþ and (d) Ac-LysHþ-Phe-(Ala)10. Relative fragmentation yield 37,500 37,550 37,600 Wavenumber (cm–1) (a) (b) (c) AB A CD B

Figure 10. [Colour online] Electronic photofragment excitation spectra of (a) Ac-Phe-(Ala)5-LysHþ, (b) Ac-Phe-(Ala)10-Lys-Hþ, and (c) Ac-LysHþ-Phe-(Ala)10. The labels in (a) and (b) denote band origins of different conformers.

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The peak near 3575 cm_1 can be assigned to the free carboxylic OH stretch of the lysine at the C-terminus. The presence of a free OH stretch band is already evidence that the molecule may be helical, since if it were to adopt a globular structure, it is likely that the carboxylic OH would find itself in a hydrogen-bonding interaction that would shift the corresponding band to lower wavenumber by an amount depending upon the strength of the interaction. The bands in the region 3300–3500 cm_1 arise from amide NH stretch vibrations. The appearance of seven bands in this region is consistent with fact that there are seven amide stretches and indicates that we are able to see all of them. These bands vary in both their position and their width – those shifted further to the red seem to be broader. The narrowest bands are only 2 cm _1 in width (before deconvolution of the OPO linewidth, which is _1cm_1), while the wider amide bands approach 6 cm _1. If the molecule is indeed helical, the narrow, higher frequency amide NH stretch bands are likely to be those that reside at the ends of the molecule and which do not participate in hydrogen bonding along the helix axis, whereas the red-shifted bands should come from the NH residues in the middle of the helix. This is confirmed by the observation that adding five additional alanines results in additional features in this red-shifted region, as shown in the IR spectrum of Ac-Phe-(Ala)10-LysHþ (Figure 11c). Notice also that this larger molecule still exhibits a free carboxylic acid OH stretch band, consistent with a helical structure. The three ammonium NH bands are shifted much further to the red of the spectrum shown here and are broadened by their strong interaction with the carbonyls; we typically observe them in the region of 3000–3200 cm_1. The infrared spectrum of Ac-LysHþ-Phe-(Ala)10 shown in Figure 11d, while not entirely different from that of the molecules that we expect to be helical, exhibits some important differences. The free carboxylic OH stretch band is missing, and a new broad band appears near 3270 cm _1, which we interpret to be a strongly hydrogen-bonded carboxylic acid OH stretch. The amide NH stretch bands in this molecule appear in the same general region of those for the previous molecules and in themselves do not allow us to distinguish between a helical and non-helical structure. However, the strong shift of the OH stretch suggests a completely different structure, since it would be difficult to construct a helix with the carboxylic OH involved in a strong hydrogen bonding interaction. Up to this point, our interpretation of the infrared spectra of these alanine-containing peptides has been based largely on spectroscopic intuition. To be able to connect the spectra we observe to the structure of the molecule, we need to compare the positions of the spectral bands with the results of calculations. We concentrate here on the smaller of the two helical peptides, Ac-Phe-(Ala)5-LysHþ, since it is more tractable theoretically. Figure 12 shows measured spectra of four different conformers of Ac-Phe-(Ala)5LysHþ together with calculated spectra for four of the lowest energy conformers of this molecule at the B3LYP/6-31þþG** level. The vibrational bands in the calculated spectra are labelled to indicate which amino acid residue they are associated with. While an attempt has been made to compare the spectrum of each conformer with the correct calculation, this can be somewhat arbitrary, since the measured spectra do not automatically come with assignments as do the calculated spectra. When there are peaks spaced on the order of the expected accuracy of the calculations, which is the case International Reviews in Physical Chemistry 499 Downloaded By: [Universidad Pablo de Olavide] At: 08:33 9 January 2010

here, there is no guarantee that the peaks we measure are ordered in the same way as the calculations. In this case a simple „resemblance‟ between the measured and calculated spectra is not sufficient to associate the calculations with the measurement and assign a structure to the conformer. The problem of assigning the measured vibrational bands to the correct amide stretches can be resolved by systematic isotopic substitution of the amide nitrogen on the different residues of the peptide. In a simple diatomic description of an amide NH stretch, substituting nitrogen-15 for nitrogen-14 would lower the NH stretch frequency by approximately 8 cm_1. Figure 13 shows the spectrum of conformer B of Ac-Phe-(Ala)5LysHþ without isotopic substitution together with the spectra with substitutions at the 2, 4 and 6 positions, counting from the N-terminus. Although we substituted only three of the seven amide nitrogens, we have measured the shifts in the spectrum of each of the four conformers, and we find that the calculated spectra do remarkably well in assigning the

various vibrational bands. Of the twelve shifted bands (i.e., three in each of the four conformers), in only one case did the calculated spectrum lead to a wrong assignment, and 3300 3350 3400 3450 Wavenumber (cm–1) Fragment depletion Ala2 Ala4 Ala5± Ala6 Ala3 Phe1 Lys7 Ala3 Ala4 Ala5± Ala6 PheLys 1 7 Ala2 (a) (b) Ala3 Ala5Ala6 Ala4 Phe1 Lys7 Ala2 (c) (d) Ala3 Ala5± Ala6 Ala4 Lys7 Phe1 Ala2 6.8 kJ/mol 2.6 kJ/mol 0.0 kJ/mol 4.2 kJ/mol

Figure 12. [Colour online] Comparison between experimental and calculated infrared spectra for conformers A-D of Ac-Phe-(Ala)5-Lys-Hþ respectively in the amide NH stretch region. The bestmatching calculated spectra are presented directly under each experimental spectrum together with the assignments of each peak to a specific amino acid residue.

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this was the reversal of Phe1 and Ala2 in conformer C (Figure 12c), which are less than 6 cm_1 apart. Overall, the verification of the calculated spectral assignments by isotopic substitution gives us confidence in attributing a particular spectrum to a specific, calculated conformer, as we have done in Figure 12. Assuming that the comparison between the observed and calculated spectra is sufficient to allow us to assign the geometry of the conformer, we can gain insight into the interactions giving rise to a particular spectral signature. We have identified four conformers in total from the electronic spectra of Figure 10a, which we label A–D, all of which are helical, as shown in Figure 14. These conformers fall into two groups – A and B have a very similar conformation (and IR spectrum) and differ mostly by the orientation of the phenylalanine side chain, and C and D, which differ from each other in the same way. The two groups differ from each other by the hydrogen-bonding pattern of the backbone. Beside each pair of conformers in Figure 14, we show schematically the connectivity of the hydrogen bonds implied by each structure. As one can see, the difference between the two groups of structures is the tightness of the coil – in A and B there is a series of interactions of the type C10–C10–C10–C13 while in C and D it appears to be C10–C10–C13– C13. The difference between the two is simply the placement of one of the hydrogen bonds, which in the case of C and D raps the helix a bit tighter. These hydrogen-bonding patterns allow us to rationalise some of the overall features of the infrared spectra. Indeed as we speculated earlier, the calculated geometries seem to confirm that the highest frequency NH stretch bands belong to terminal amino acid Fragment depletion 3250 3300 3350 3400 3450 Wavenumber (cm–1) 15N-Ala2 15N-Ala4 15N-Ala6 14N

Figure 13. [Colour online] Conformer-specific IR spectra of Ac-Phe-(Ala)5-Lys-Hþ with nitrogen-15 substitution at specific amino acid residues, numbered from the N-terminus. The unsubstituted

peptide spectrum is shown at the top, with the singly substituted peptides shown underneath. The shifted peaks are circled, while a dashed line shows the position of those transitions in the unsubstituted peptide.

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residues that are not directly involved in the hydrogen bonding network associated with the helical backbone; namely the lysine, the phenylalanine and the first alanine from the N-terminus. The remaining amide NH bands are significantly red-shifted, although not all to the same degree. The difference between them is likely to reflect details in the CO–NH distance, the alignment of the CO and NH within the hydrogen bond and perhaps effects of cooperativity among hydrogen bonds along the helical axis. We can also see that in a helical configuration the C-terminal OH seems not to be involved in any strong hydrogen bonding interactions and should produce a free OH stretch band, which is consistent with the measured spectra. We can also get some qualitative information about the relative energies of the different conformers. The relative intensities of the different conformer band origins in the electronic spectrum of Figure 10a carry some information on the relative energies of the conformers, but one must be careful in making a direct correlation. The intensities depend both on the conformer population and the oscillator strength for the UV transitions, and the latter can differ from one conformer to the next. Even if the band origins of different conformers were to have the same oscillator strengths, it is unlikely that the relative conformer populations (as determined by the intensities) would be related to the relative energies of the conformers in a simple way. As the molecules cool by collisions with cold helium, some will get trapped in local potential wells with barriers that divide one conformer well from another. The relative conformer populations will thus depend more on the height of the barriers to interconversion and the collisional cooling rate than on their relative energies. If this were not the case, all four conformers Figure 14. Calculated structures for conformers A–D of Ac-Phe-(Ala)5-Lys-Hþ with the relative zero-point-corrected energies in kilojoules per mole indicated. The hydrogen bonding schemes for each pair of conformers is shown to the right.

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would have to be extremely close in energy to have appreciable populations at a temperature of 15 K. Despite the lack of quantitative connection between the spectral intensities for the different conformers (and hence their populations) and the conformer energy, we can deduce the relative energy ordering, since the lower energy conformers should be more highly populated. Barring any dramatic difference in oscillator strength for the relative band origins, the electronic spectrum of Figure 10a would predict that conformers A and B are the lowest in energy followed by C and D. This is different than our calculations, which predicts energies of 6.8, 2.6, 4.2, and 0 kJ/mol for conformers A–D, respectively (Figure 12). A detailed systematic study of computational methods is needed to resolve this discrepancy between theory and experiment. It seems clear that conformer-specific infrared spectra are able to distinguish the two classes of conformers – A and B compared to C and D. This is enabled largely by the high resolution afforded by the cooling in our ion trap since much of this structure would be hidden in room temperature spectra. While the comparison here between experiment and theory is far from perfect, the high-resolution spectra that can be obtained using this approach provide an important benchmark for theory, particularly since the complicating effects of solvent are eliminated. 6. Toward still larger molecules We have demonstrated the ability to measure highly resolved infrared spectra of small gas-phase peptides, which provide a benchmark for theoretical calculations. Even though high-resolution spectra of molecules of this size may push the limits of theory, there are reasons for us to want to apply these techniques to still larger molecules. Peptides of up to 10–12 amino-acids described above are at the lower limit of what is required to fully develop secondary structure – moving to still larger molecules would perhaps further stabilise such structural features and allow us to observe elements of tertiary structure such as interacting helices. Moreover, it is more likely that larger molecules will retain something that resembles their condensed-phase structure in the gas phase since the accumulation of many non-covalent interactions will make a considerable contribution to the overall stabilisation energy. Our ultimate goal is to be able to extract useful

structural information, even if it is only qualitative, on naturally occurring peptides and proteins. The first question that arises is whether the spectra of still larger molecules will be simple enough to extract any information. The UV spectrum of Ac-Phe-(Ala)10-LysHþ, the largest of the molecules discussed above, is uncongested and allows us to measure conformer-specific IR spectra without difficulty. While not fully resolved under the conditions that we employ, these IR spectra could be further resolved with improvements in our IR laser resolution. As we move to larger molecules, at some point a large distribution of stable conformers, which we have not observed until now, might become the major source of spectral congestion. Once conformational heterogeneity becomes the limiting factor, combining our techniques with other experimental methods, such as ion mobility, might help reduce the problem. For the moment, our goal is to explore the limits of our current techniques. International Reviews in Physical Chemistry 503 Downloaded By: [Universidad Pablo de Olavide] At: 08:33 9 January 2010

Putting aside for the moment questions of spectral complexity, if we wish to push these techniques to still larger molecules, there are two questions that must be addressed from an experimental point of view: . Will we be able to dissociate larger molecules with a single UV photon for photofragment-based detection? . Will infrared depletion spectroscopy work on larger molecules? We present here some of our most recent experimental developments that allow us to address these questions [70]. The use of spectroscopic techniques based on UV photofragmentation requires that the molecules initially promoted to an excited electronic state will dissociate on a short enough timescale compared to competing processes. If the molecules dissociate directly from an excited electronic state, the process is typically fast, and the lifetime should not scale with molecular size. In this case, the techniques described above might work perfectly well on larger molecules. However, if the dissociation occurs first by internal conversion to the ground electronic state followed by statistical vibrational energy redistribution and unimolecular dissociation, the lifetime of the molecule could scale strongly with the number of vibrational modes. If this were the case, processes that compete with unimolecular dissociation, such as collisional relaxation by residual helium in the ion trap or infrared fluorescence, might reduce the fraction of molecules that dissociate, rendering photofragment spectroscopy of large species difficult if not impossible. In the experiments described thus far, the cadence of the experiment was determined by the laser repetition rate. The trapping cycle is repeated every 50 ms, and depending upon the specific experiment, the lasers operate at either 10 or 20 Hz. During a typical trapping cycle, the molecules cool in collisions with helium during the first 10 ms, and then we leave up to 30 ms for the helium to be pumped away. Since we excite the molecules with a UV laser pulse 40 ms into the trapping cycle, this leaves at most 10 ms for them to dissociate. To extend this time, we could run the lasers and the trapping cycle at half the repetition rate or less, and this would allow up to 100 ms for the molecules to dissociate, albeit at the expense of the duty cycle of the experiment. Unfortunately, on this timescale, radiative cooling can become significant and may compete with dissociation. To deal with this problem we apply a technique similar to one we used in the past for photofragment spectroscopy of weak vibrational overtone transitions, which we called infrared laser-assisted photofragment spectroscopy (IRLAPS) [96–98]. The basic idea as applied to the current experiments is illustrated in Figure 15 [70]. Suppose that after UV excitation of a large, gas-phase peptide, unimolecular dissociation is slow, and only a small fraction of the molecules produce fragments in the time before the trap is emptied. By introducing a CO2 laser pulse subsequent to the UV pulse, we can induce infrared multiphoton excitation of the pre-excited peptide molecules, increasing their vibrational energy and hence their dissociation rate. This should cause a significantly larger fraction of molecules to dissociate during the fixed time before the trap is emptied. For this approach to work, the CO2 laser pulse must selectively excite only those molecules that are first promoted to the excited electronic state and not those that remain in the ground electronic state. If this is achieved, an electronic spectrum can be recorded in the same way as before – by observing the fragment ion signal as a function of the UV laser frequency. There are two factors that may allow us to selectively dissociate only those 504 T. R. Rizzo et al.

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molecules that have first undergone UV pre-excitation, similar to the situation in our previous work on small, vibrationally-excited polyatomic molecules [96,97]. First, since the pre-excited molecules already have on the order of 37000 cm _1 of internal energy, they need to absorb fewer photons from the CO2 laser (compared to those not receiving the UV excitation) to reach an energy at which the dissociation rate becomes sufficiently fast. We can therefore use the CO2 laser fluence as a parameter to discriminate against dissociating unexcited molecules, since at sufficiently low fluence they will not gain enough energy. The second factor relates to the CO2 laser frequency used. Because the ions in our trap are cold, their infrared absorption in the CO2 laser region should be sharp, whereas those that have first been excited with the UV laser and undergone internal conversion are internally warm. If we tune the CO2 laser away from a resonant frequency of the cold, ground state molecules, excitation of these molecules by the CO 2 laser alone should be inefficient, while the internally warm pre-excited molecules should have broad infrared absorption and be preferentially pumped by the CO2 laser. As a demonstration of this technique, we show in Figure 16 electronic photofragment excitation spectra of a seventeen amino acid peptide, Ac-Phe-(Ala)7-LysHþ-(Pro)2-(Ala)5Lys Hþ, obtained with only the UV excitation laser and with the addition of the CO2 laser [70]. In the former case we observe less that one fragment ion per laser pulse, even on the strongest peaks, but as shown in the figure, this increases by over two orders of magnitude when assisted by the CO2 laser. Having demonstrated the effectiveness of this approach for electronic spectroscopy, we now consider whether we can use it to measure conformer-selective infrared spectra. In this case, an IR spectroscopic laser would precede the UV laser in the same way as for the smaller systems described above, and the infrared absorption would be detected as a dip on the fragment ion signal. There are two questions related to the successful implementation of this approach that need to be addressed. First, can the CO2 laser dissociate selectively only those molecules promoted to the excited electronic state and not those first excited with infrared radiation? After absorption of the IR photon for the spectroscopic S0 S1 D0 MH+ *MH+ ‡‡ MH+ A + B+ A + B+ UV Fast Slow

IRMPE

Figure 15. [Colour online] Excitation scheme for the application of IRLAPS for measuring the electronic spectrum of large, protonated biomolecular ions.

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excitation, the molecule becomes internally warm, and the absorption spectrum in the region of the CO2 laser will no longer be sharp. This simply leaves the possibility to discriminate only on the basis of the CO2 laser fluence and not its frequency. The second question is whether in such a large molecule the infrared absorption will cause a dip in the UV-induced fragmentation. As the molecule becomes larger with more vibrational modes, the degree of internal warming caused by the IR excitation and the accompanying spectral broadening responsible for the dip in the UV spectrum, should decrease. Figure 17 shows two infrared spectra of the seventeen amino acid peptide Ac-Phe(Ala)7-LysHþ-(Pro)2-(Ala)5-Lys Hþ recorded with the UV laser set on the peaks labelled A and B in the electronic spectrum of Figure 16 [70]. The degree of depletion achieved by the IR spectroscopic laser is as much as 62%, which clearly indicates that the CO 2 laser can selectively dissociate the electronically excited molecules. Moreover for a molecule this size, adding on the order of 3400 cm _1 of vibrational excitation is still sufficient to broaden and shift the electronic spectrum to result in a dip at the UV probe frequency, allowing us to measure an infrared spectrum. Although these spectra are not completely resolved, one can clearly see that they are distinctly different, indicating that the features in the UV spectrum arise from different stable conformers. The application of IRLAPS to UV photofragment spectroscopy of larger biological molecules is still in its infancy and there are many questions about the mechanism that still need to be addressed. While we expected that dissociation of UV-excited ions would normally proceed on the ground electronic potential energy surface in a statistical manner,

there are two observations that suggest that this may not be the case. The first is the fact that the fragmentation channel that seems always to be most enhanced by infrared multiphoton excitation in the IRLAPS scheme is the loss of the neutral aromatic side chain by cleavage of the C__C_ bond, despite the fact that it is not the weakest bond in the molecule. We deduce the latter from our observation that in collision-induced dissociation and in IRMPD of the parent molecules, both of which should proceed on the ground Relative fragment ion signal 37,500 37,520 37,540 37,560 37,580 37,600 Wavenumber (cm–1) A B

Figure 16. [Colour online] Electronic spectrum of Ac-Phe-(Ala)7-LysHþ-(Pro)2-(Ala)5-LysHþ obtained (a) by UV photofragment spectroscopy (blue line), and (b) by IRLAPS in which the UV excitation is assisted by infrared multiphoton excitation by a CO2 laser (red line). In both cases the fragment with m/z of 710 is monitored. The CO2 laser was tuned to the 9P(16) line at 1050.1 cm_1.

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electronic surface, breakage of the C__C_ bond is a minor channel. Secondly, the fragmentation appears to occur promptly after CO2 laser excitation, since the dissociation yield does not drop when we shorten the time allowed for dissociation. We would expect that if dissociation occurred in a statistical manner from highly excited levels of the ground electronic state, the rate would get progressively slower with increasing size of the molecule. Our observations suggest that the dissociation induced by the CO 2 laser may occur on an excited electronic surface or in an intermediate species that is promptly formed after UV excitation. While the dissociation mechanism in the IRLAPS scheme continues to be a subject of study in our laboratory, the open questions might be best addressed by the powerful coincidence techniques of Jouvet et al. [99–101]. 7. Limitations and future directions In this section we consider potential limitations to our present technique, methods that might be used to overcome such limitations as well as possible extensions to the technique that we can envisage for the future that would provide even more detailed information. It is clear that as we push to larger molecules, both the electronic and vibrational spectra will eventually become more complex. Complexity in the electronic spectra will limit our ability to measure conformer-specific infrared spectra. If the infrared spectra themselves are too congested, they may still serve as a fingerprint of the molecule, but the comparison with theory will be difficult, and hence it will be difficult to extract detailed information about the nature of the forces that drive a molecule to adopt a particular conformation. The factors that limit these two types of spectra are slightly different. For electronic spectra, if we assume that we can continue to cool larger molecules efficiently, which eliminates thermal inhomogeneous broadening, the remaining possible sources of spectral congestion are a larger number of Franck–Condon active low-frequency vibrations and a large number of stable conformers with slightly different electronic spectra. As discussed previously, the first of these factors is difficult to estimate a priori. Relative fragment depletion 3200 3300 3400 3500 3600 Wavenumber (cm–1) (a) Conformer A (b) Conformer B

Figure 17. Conformer-specific IR spectra of Ac-Phe-(Ala)7-LysHþ-(Pro)2-(Ala)5-LysH+ obtained by depleting the IRLAPS signal with the UV laser set on the features marked A and B in Figure 16. Adapted with permission from [70]. Copyright 2006 American Chemical Society.

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While one can estimate the number of low frequency vibrations, it is difficult to predict which ones will have strong Franck–Condon activity. However, there is reason to believe that this problem will remain manageable, since the vibrational modes that change geometry in the excited state should only be those near the chromophore. The problem of conformational heterogeneity will likely become a serious problem for molecules significantly larger than those presented here. The use of „multi-dimensional‟ techniques in spectroscopy has proven to be a powerful way to remove heterogeneous broadening. In the work described above, we used IR–UV double-resonance to allow conformer specific IR spectra. Using higher orders of multiple resonance such as IR–IR– UV schemes [42] should allow extensions to more complex systems. However, one could imagine other „dimensions‟ in which to distinguish the spectra of different conformers. For

example, the combination of ion mobility techniques, which can first select a certain family of conformations by their mobility in drifting through a finite pressure of bath gas, with the kind of ion-trap spectroscopy described here should be able to reduce the number of features in an electronic spectrum by physically separating the conformers before injection into the trap. An additional source of spectral complexity in electronic spectra will arise as we begin to examine naturally occurring peptides and proteins, which are likely to contain multiple aromatic amino acids. The transitions centred on these distinct chromophores may overlap and interact, particularly when the chromophores are of the same type. Interactions between different chromophores do not in themselves pose a problem, as the electronic spectrum is simply used to perform conformer selection, however the overlap of spectra may inhibit conformer selection. This is clearly an inherent limitation of using naturally occurring chromophores, which is no different from problems experienced in solution, where some studies have concentrated on proteins with a single tryptophan residue. One solution would be to introduce non-natural chromophores into a peptide or protein in such a way that does not perturb the overall structure of the molecule. These could be chosen to have electronic absorptions distinct from the aromatic amino acids. The question of complexity in the infrared spectra is closely tied to our ability to select single conformations via an electronic excitation and then use IR–UV double resonance; hence the two types of spectra are not completely independent. However, even if electronic spectra are simple enough to allow the selection of a single stable conformation, it does not guarantee that the vibrational spectrum will be simple, since large molecules, particularly those with repeating units such as peptides, will have a large number of vibrational bands in similar environments that will overlap. Exactly how many vibrational bands appear in a spectrum depends upon the mechanism of IR–UV double resonance. As described in much of the work on neutral molecules, the dip in a fluorescence or ion signal upon IR excitation comes from depopulation of the initial state that is tagged by a UV transition. The language commonly used to describe this process assumes that once vibrationally excited, the molecules no longer absorb the UV laser at the same frequency, and this causes a dip in the signal. However it is important to understand why the UV absorption frequency shifts once a molecule is vibrationally excited. If the shift comes from a coupling between the vibrational and electronic excitations, then the vibrational bands that cause a dip in the UV signal will be those that have strong Franck–Condon factors for Dv 6¼0 transitions in the electronic transition. In other words, if the molecules are excited to a particular v¼1 vibrational level and that mode has a strong Franck–Condon factor for a Dv¼0 508 T. R. Rizzo et al. Downloaded By: [Universidad Pablo de Olavide] At: 08:33 9 January 2010

transition, the electronic absorption will not be very different from the ground state molecules, and the IR absorption will not result in a depletion of the photofragmentation signal. If, on the other hand, the molecules are excited to the v¼1 level of a vibrational mode with a weak Dv¼0 Franck–Condon factor, the electronic absorption will be weaker than that for unexcited molecules, and the photofragment signal will dip. If this is the correct interpretation, then one might expect that only a small subset of vibrational modes will contribute to the infrared spectrum – that is, modes in the vicinity of the UV probe chromophore for which one might expect a geometry change upon electronic excitation. However, this interpretation implicitly assumes that there is no intramolecular vibrational energy redistribution on the timescale of the delay between the IR pump and UV probe lasers. Since the delay is typically 200 ns, this prospect seems unlikely. A more likely scenario is that after IR excitation, the vibrational energy redistributes among the vibrational modes of the molecule, putting it in states of mixed vibrational character. Such states will have components of their wave functions that represent population in many low frequency vibrational modes since the density of states of this type is the highest. The UV spectrum of a molecule in such states will be broadened by what is sometimes referred to as „statistical inhomogeneous broadening‟ [102,103], which comes about because the different components of the mixed wave function will give rise to slightly different UV absorption frequencies. Because the UV spectrum is broadened compared to the cold, unexcited molecule, the intensity of UV absorption will be lower at the resonant frequency of the cold molecule, and thus one observes a dip. While the result may appear the same as if we simply removed population from the ground state and assumed no intramolecular vibrational energy redistribution, the scaling of the complexity of the infrared spectrum with molecular size will depend on the mechanism responsible for the IR-induced dip.

If the vibrational energy is statistically distributed after IR excitation, then all vibrational modes of the molecule will appear in the IR dip spectrum. This means that the complexity of the vibrational spectrum will continue to increase with the size of the molecule and that the IR spectrum will not be a local probe of the chromophore region. Moreover, as the molecule gets larger, the excited vibrational state will consist of a wider mixture of states involving modes further from the chromophore. Because these modes will tend to have strong Franck–Condon factors for Dv¼0 transitions, the degree of broadening will decrease roughly in proportion to 1/(SQRT(S)), where S is the number of mixed states. This implies that with increasing molecular size the degree of dip in the spectrum will decrease, making it increasingly difficult to measure IR spectra. Exactly what size molecule is required to put us in that regime is not completely clear. At least for peptides of seventeen amino acids, the amide NH stretch bands appear with significant intensity. While one of the primary goals of these experiments is to test theory, the need for theory to provide the connection between the measured vibrational spectrum and molecular structure is perhaps one of our ultimate limitations to using the data. The connection between theory and experiment is discussed in more detail below. 8. State of comparison with theory We have presented the results of reasonably complete DFT calculations at the B3LYP/ 6-31þþG** level for the protonated amino acids and B3LYP/6-31G** for Ac-Phe-(Ala)5LysHþ. Although these calculations, with assistance from isotopic labelling, allowed us to International Reviews in Physical Chemistry 509 Downloaded By: [Universidad Pablo de Olavide] At: 08:33 9 January 2010

assign individual transitions to particular oscillators and to connect the spectra to specific conformations, we still found disagreements between theory and experiment. Moreover, we were unable to apply these same methods to the larger molecules discussed in this review. This section outlines the strengths and weaknesses of our chosen procedures, suggests methods that might improve on the current results, and discusses the difficulties encountered as we move to larger molecules. The first step in obtaining a set of calculated geometries and frequencies is to use a low level of theory to identify candidate structures for further analysis. We employ a random search method for conformational searching using the AMBER force field. In the case of Ac-Phe-(Ala)5-LysHþ we generated 50,000 structures, of which just over 1000 were unique and within 50 kJ/mol of the most stable structure. When we calculated the energies of these conformations using B3LYP/6-31G**, the energy ordering changed considerably. For example, the global minimum conformation of Ac-Phe-(Ala)5-LysHþ, according to DFT (assigned as conformer D) was the 35th lowest energy conformation according to AMBER. However, when the conformations were fully optimised with DFT, further reordering was minimal. Thus, while the AMBER force field calculates geometries that do not change much at higher levels of theory, the energy ordering is not as reliable. The problem of correctly selecting low-energy conformations with force field methods likely becomes more difficult in systems other than these helices, which seem to be particularly stable [94]. Because the random search procedure uses low-energy structures to generate new structures during the search, and because the helices are so much lower in energy than other types of structures, the search procedure will stay mostly within the helical regime, allowing it to fully explore that small region of conformation-space that accounts for all of the low-energy conformations. By contrast, a potential energy surface with a wider variety of structures within a smaller energy window may not be as thoroughly explored within the same number of iterations. Once a set of candidate structures have been identified by force field searches, we then employ higher-level calculations to find the very lowest minima, and to calculate harmonic vibrational frequencies. We employ the B3LYP functional with a 6-31þþG** basis for smaller systems and 6-31G** for larger ones. In previous sections, we have identified two weaknesses with our DFT calculations: the energy ordering for Ac-Phe-(Ala)5-LysHþ does not match the apparent conformational populations seen in the spectra; and there is still substantial error in the calculated frequencies compared to the experiment. We look at these factors in turn. As discussed above, one should use caution when assuming conformer populations based on UV spectra because of possible differences in transition strengths for the different conformers. If we assume that the UV spectrum reflects the actual populations, the precise ordering of the lowest energy conformations in Ac-Phe-(Ala)5-LysHþ does not appear correct. We should emphasise, however, that the four observed conformations are among

the five lowest calculated, implying that DFT does recover the overall energetics reasonably well. The detailed differences may be due to the well-known lack of dispersion in DFT. In smaller molecules containing aromatic rings and amide groups, the interaction between the two can be an important stabilising factor that determines the lowest energy conformations [24]. In helices, this type of interaction is much less important than hydrogen bonding, but the complete omission of dispersion interactions may account for differences of several kilojoules per mole. 510 T. R. Rizzo et al. Downloaded By: [Universidad Pablo de Olavide] At: 08:33 9 January 2010

On the whole, the scaled DFT harmonic frequency calculations are good enough to allow us to relate a structure to the measured spectra for the protonated aromatic amino acids and for Ac-Phe-(Ala)5-LysHþ, and to identify particular weaknesses in the theory. The IR spectra of PheHþ (Figure 6) point out a recurring weakness – the poor calculation of hydrogen-bonded ammonium NH stretches. Calculations using MP2 provided no improvement to these frequencies, ruling out dispersion as the source of the problem. Anharmonic frequencies, on the other hand, improved the agreement substantially with the added advantage of requiring no scale factor. We thus concluded that anharmonicity in hydrogen-bonded ammonium NH stretches is so large that normal harmonic methods, even when scaled, were insufficient to determine accurate frequencies. The calculation of conformations A and B of Ac-Phe-(Ala)5-LysHþ point to a second flaw in this level of theory – the coupling between the NH stretches of Ala5 and Ala6 [65,69]. The calculations suggest vibrations that are the symmetric and antisymmetric combinations of the two local oscillators, with nearly equal intensity and a substantial spacing between them, while the experiment shows two vibrations with markedly unequal intensity and only a slight splitting. Larger molecules are likely to have many coupled oscillators, and thus correct prediction of this interaction is crucial. In general, the mismatch between the calculated and experimental frequencies will become problematic for larger molecules with congested spectra and smaller differences between conformations. There are several options for improvements to the calculations we have discussed here. The shape of the potential energy surface is, of course, the primary factor in the accuracy of the energies and the frequencies, so improvements in DFT and inclusion of dispersion in future calculations will ameliorate this to some degree [104–109]. Moving to higher levels of theory than DFT may also be a necessary step. The computational expense of MP2 has precluded its general use in the size of molecules we study, but the development of the resolution-of-the-identity (RI) approximation offers a less expensive route to MP2 energies [110]. Finally, it is clearly necessary to include anharmonicity in the frequency calculations, but this remains quite expensive. The methods outlined here that worked well for Ac-Phe-(Ala)5-LysHþ were too computationally expensive for application to Ac-Phe-(Ala)10-LysHþ. The use of the RI approximation with DFT offers an order-of-magnitude reduction in computation time for optimisations and frequency calculations of molecules the size of Ac-Phe-(Ala)10-LysHþ. For example, we have found that frequencies can be calculated for Ac-Phe-(Ala)10-LysHþ at the RI-BP86/SVP level of theory in approximately the same time as a frequency calculation of Ac-Phe-(Ala)5-LysHþ at the B3LYP/6-31G** level. However, we used Ac-Phe-(Ala)5LysHþ to test the accuracy of RI-BP86/SVP frequencies, and found a worse match to our experimental frequencies than with B3LYP/6-31G**. Employing a larger basis set gave better frequencies, but even RI-BP86/TZVP was prohibitively expensive for Ac-Phe(Ala)10-LysHþ. Continued refinement of basis sets, functionals, and time-saving approximations will aid the field of large-molecule high-resolution spectroscopy immensely. 9. Conclusions In this review we have tried to demonstrate the potential of the techniques that we have developed for obtaining conformation-specific IR spectra of cold biomolecular ions. The combination of electrospray ionisation for producing gas-phase peptides, ion-trapping International Reviews in Physical Chemistry 511 Downloaded By: [Universidad Pablo de Olavide] At: 08:33 9 January 2010

techniques to cool and confine them and multiple-laser spectroscopic schemes enable the measurement of highly resolved electronic spectra of these species. Using such spectra to identify electronic transitions from different conformers permits the measurement of conformer-specific IR spectra, which, in comparison with calculations, allows us to identify the geometry of the molecules. The particular class of molecules discussed here was chosen because of their propensity to form gas-phase helices, allowing us to

investigate the spectral signatures of this secondary structural element. The highly resolved spectra for such species provide stringent benchmarks for theory. If one is to have confidence in theoretical calculations on molecules even larger than these in more complex environments, such calculations must be able to reproduce the spectra obtained here in the well-defined and controlled environment of a cold ion trap. It is our hope that such benchmark experiments can help provide the means to improve theoretical approaches. The continued development of these techniques requires a detailed understanding of the sources of complexity in the electronic spectra of large molecules, the photophysics of biological chromophores in their excited electronic states and the dynamics of intramolecular vibrational energy distribution in the ground electronic state, and these are subjects that are currently under investigation in our laboratory. Acknowledgements We gratefully acknowledge and thank the E´ cole Polytechnique Fe´de´rale de Lausanne and the Fond National Suisse (grant no. 200020-112071) for their generous support of this work. The studies discussed in this article are the result of the work of many talented group members: Sebastien Mercier, Monia Guidi, Caroline Seaiby, Ulrich Lorenz and Georgios Papadopoulos.

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[81] P. C. Hariharan and J. A. Pople, Theoretica Chimica Acta 28, 213 (1973). [82] A. Lindinger, J. P. Toennies, and A. F. Vilesov, J. Chem. Phys. 110, 1429 (1999). [83] L. I. Grace, R. Cohen, T. M. Dunn, D. M. Lubman, and M. S. de Vries, J. Mol. Spectrosc. 215, 204 (2002). [84] K. T. Lee, J. Sung, K. J. Lee, Y. D. Park, and S. K. Kim, Angew. Chem. Int. Edit. 41, 4114 (2002). [85] C. R. Cantor and P. R. Schimmel, Techniques for the study of biological structure and function (W. H. Freeman, San Francisco, 1980). [86] O. V. Boyarkin, S. R. Mercier, A. Kamariotis, and T. R. Rizzo, J. Am. Chem. Soc. 128, 2816 (2006). [87] F. O. Talbot, T. Tabarin, R. Antoine, M. Broyer, and P. Dugourd, J. Chem. Phys. 122, 061101 (2005). [88] N. M. Lakin, R. V. Olkhov, and O. Dopfer, Faraday Discuss. 118, 455 (2001). [89] H. Kang, C. Dedonder-Lardeux, C. Jouvet, S. Martrenchard, G. Gregoire, C. Desfrancois, J. P. Schermann, M. Barat, and J. A. Fayeton, Phys. Chem. Chem. Phys. 6, 2628 (2004). [90] H. Kang, C. Dedonder-Lardeux, C. Jouvet, G. Gregoire, C. Desfrancois, J. P. Schermann, M. Barat, and J. A. Fayeton, J. Phys. Chem. A 109, 2417 (2005). [91] H. Kang, C. Jouvet, C. Dedonder-Lardeux, S. Martrenchard, C. Charriere, G. Gregoire, C. Desfrancois, J. P. Schermann, M. Barat, and J. A. Fayeton, J. Chem. Phys. 122, 084307 (2005). [92] W. H. Qiu, L. Y. Zhang, O. Okobiah, Y. Yang, L. J. Wang, D. P. Zhong, and A. H. Zewail, J. Phys. Chem. B 110, 10540 (2006). [93] J. A. Stearns, O. V. Boyarkin, and T. R. Rizzo, Chimia 62, 240 (2008). [94] R. R. Hudgins, M. A. Ratner, and M. F. Jarrold, J. Am. Chem. Soc. 120, 12974 (1998). [95] R. R. Hudgins and M. F. Jarrold, J. Am. Chem. Soc. 121, 3494 (1999). [96] R. D. F. Settle and T. R. Rizzo, J. Chem. Phys. 97, 2823 (1992). [97] O. V. Boyarkin, R. D. F. Settle, and T. R. Rizzo, Ber. Bunseges. Phys. Chem. 99, 504 (1995). [98] O. V. Boyarkin, L. Lubich, R. D. F. Settle, D. S. Perry, and T. R. Rizzo, J. Chem. Phys. 107, 8409 (1997). [99] B. Lucas, M. Barat, J. A. Fayeton, C. Jouvet, P. Carcabal, and G. Gregoire, Chem. Phys. 347, 324 (2008). [100] B. Lucas, M. Barat, J. A. Fayeton, M. Perot, C. Jouvet, G. Gregoire, and S. B. Nielsen, J. Chem. Phys. 128, 64302 (2008). [101] G. Gregoire, B. Lucas, M. Barat, J. A. Fayeton, C. Dedonder-Lardeux, and C. Jouvet, Eur. Phys. J. D 51, 109 (2009). [102] A. Stuchebrukhov, S. Ionov, and V. Letokhov, J. Phys. Chem. 93, 5357 (1989). [103] A. A. Makarov, I. Y. Petrova, E. A. Ryabov, and V. S. Letokhov, J. Phys. Chem. A 102, 1438 (1998). [104] J. D. Chai and M. Head-Gordon, J. Chem. Phys. 128, 084106 (2008). [105] T. Benighaus, R. A. DiStasio, R. C. Lochan, J. D. Chai, and M. Head-Gordon, J. Phys. Chem. A 112, 2702 (2008). [106] H. Valdes, V. Spiwok, J. Rezac, D. Reha, A. G. Abo-Riziq, M. S. de Vries, and P. Hobza, Chem.- Eur. J. 14, 4886 (2008). [107] Y. Zhao and D. G. Truhlar, Theor. Chem. Account 120, 215 (2007). [108] Y. Zhao and D. G. Truhlar, J. Chem. Theory Comput. 3, 289 (2007). [109] J. Cerny, P. Jurecka, P. Hobza, and H. Valdes, J. Phys. Chem. A 111, 1146 (2007). [110] F. Weigend, M. Haser, H. Patzelt, and R. Ahlrichs, Chem. Phys. Lett. 294, 143 (1998).

Modelos de cálculo teórico:

Los espectros de DOR y DC de los dos enantiómeros de una molécula quiral son de igual magnitud y signo opuesto: es decir, la imagen de espejo enantiómeros dar imagen especular espectros de DOR y DC. En consecuencia, el aire acondicionado de una molécula quiral puede, en principio, se determina a partir de la ORD y / o espectro de CD. 

AC - propiedades Chiroptical: Luz polarizada à suma de dos componentes de polarización circular de la misma magnitud y fase opuesta. ORD sólo à componentes de transmisión se mantendrá la misma intensidad (EL = ER), pero la fase cambiará. Los fenómenos de refracción se produce desde índices de izquierda y derecha circularmente la luz polarizada son diferentes. medimos el ángulo de rotación: a (grados) CD sólo à EL y ER se absorbe de forma diferente. Se lleva a cabo cuando los componentes arriba se absorbe de forma diferente. medimos elipticidad ángulo: Q o en el rango IR = VCD diferencia de absorción: D A para ángulos pequeños: A D @ Q ° / 32.98 Para las muestras de CD y activa ORD tendremos a Q y al mismo tiempo

•

New ab initio, density functional and semiempirical calculation methods

•

New desorption methods and their combination with storage techniques allow the production of high densities of large molecules

•

New double resonance spectroscopy techniques allow selection of isomers

•

Spectroscopic methods applied to electrosprayed molecules

•

New lasers and new IR generation technique extend the conventional wavelength range and increase laser power and stability of laser intensity

Nueva ab initio, la densidad de los métodos de cálculo funcional y semiempíricos • Nuevos métodos de desorción y su combinación con las técnicas de almacenamiento permiten la producción de alta densidad de moléculas de gran tamaño • Nuevas técnicas de espectroscopia de resonancia doble permite la selección de los isómeros • Los métodos espectroscópicos se aplica a moléculas electrosprayed • nuevos láseres de nueva generación y la técnica de infrarrojos ampliar la gama de longitudes de onda convencional y aumentar la potencia de láser y la estabilidad de la intensidad del láser

•

9.

• Conclusiones: En esta revisión se ha tratado de demostrar el potencial de las técnicas que hemos desarrollados para la obtención de la conformación específica de espectros IR de los iones biomoleculares frío. La combinación de ionización electrospray para la producción de péptidos en fase gaseosa, de iones que atrapan Comentarios Internacional de Química Física 511 Descargado por: [Universidad Pablo de Olavide] En: 08:33 09 de enero 2010 técnicas que se enfríe y las confinan y permitir que múltiples sistemas de espectroscopia láser de la medición de los espectros de una alta resolución electrónica de estas especies. El uso de tales espectros de identificar las transiciones electrónicas de diferentes confórmeros permite la medición de conformación específica de espectros IR, que, en comparación con los cálculos, nos permite identificar la geometría de las moléculas. La clase particular de moléculas discutido aquí fue elegido debido a su propensión a formar la fase gaseosa-hélices, lo que nos permite investigar las firmas espectrales de este elemento estructural secundaria. La resuelto muy espectros de estas especies constituyen puntos de referencia estrictos para la teoría. Si uno va a tener la confianza en los cálculos teóricos sobre las moléculas aún mayores que estas, en más complejo entornos, estos cálculos deben ser capaces de reproducir los espectros obtenidos aquí en el bien definido y controlado por medio de una trampa de iones de frío. Es nuestra esperanza de que tal experimentos de referencia puede ayudar a proporcionar los medios para mejorar los enfoques teóricos.

El continuo desarrollo de estas técnicas requiere una comprensión detallada de las fuentes de la complejidad de los espectros electrónicos de moléculas de gran tamaño, el fotofísica de cromóforos biológicos en sus estados excitados electrónicos y la dinámica de la distribución intramolecular de energía vibracional en el estado fundamental, y estas son temas que están actualmente bajo investigación en nuestro laboratorio. El análisis de vibración de los aminoácidos y péptidos cortos en los medios de comunicación hidratada. VIII. amino Los ácidos con cadenas laterales aromáticas: L-fenilalanina, Ltirosina y L-triptófano.

Vibrational Analysis of Amino Acids and Short Peptides in Hydrated Media. VIII. Amino Acids with Aromatic Side Chains: L-Phenylalanine, L-Tyrosine, and LTryptophan Bele´n Herna´ndez,† Fernando Pflu¨ ger,† Alain Adenier,‡ Sergei G. Kruglik,§ and Mahmoud Ghomi*,† Groupe de Biophysique Mole´culaire, UFR SMBH, UniVersite´ Paris 13, 74 rue Marcel Cachin, 93017 Bobigny cedex, France; Laboratoire ITODYS, UMR 7086, UniVersite´ Paris Diderot, Baˆtiment LaVoisier, 15, rue Jean-Antoine de Baı¨f, 75205 Paris cedex 13, France; and Laboratoire Acides Nucle´iques et Biophotonique (FRE 3207), UniVersite´ Pierre et Marie Curie Paris 06, 75252 Paris, France ReceiVed: July 21, 2010; ReVised Manuscript ReceiVed: October 4, 2010

IV. Concluding Remarks Our main conclusions can be summarized as follows: (i) Despite the very low water solubility of tyrosine, we could finally record for the first time its Raman and FT-IR spectra in aqueous solutions (Figure 3). This was only made possible at a minimal concentration of 2.3 mM (0.42 mg/ mL), just below the saturation condition of Tyr in aqueous solution. (ii) Phe and Trp give rise to intense Raman bands (Figure 2 and 5), originating from the in-plane vibrations of aromatic side

chains. These modes serve as useful vibrational markers in peptides and proteins. For instance, we can mention that the Raman spectra obtained from somatostatin, a 14-mer peptide hormone containing three Phe and one Trp residues in its chain, reported in paper V of this series,48 are dominated by the intense bands arising from these AAs. (iii) The common feature of all the AAs with an aromatic ring, i.e., His,32 Phe, Tyr, and Trp, is their side-chain conformational flexibility thanks to the variation of _1 and _2 torsion angles (Figure 1). As evidenced by quantum mechanical calculations, their side chain can sweep a large space, rendering possible their interactions with the environment. Especially, water molecules, through their interactions with these AAs, seemIV. Concluding Remarks Our main conclusions can be summarized as follows: (i) Despite the very low water solubility of tyrosine, we could finally record for the first time its Raman and FT-IR spectra in aqueous solutions (Figure 3). This was only made possible at a minimal concentration of 2.3 mM (0.42 mg/ mL), just below the saturation condition of Tyr in aqueous solution. (ii) Phe and Trp give rise to intense Raman bands (Figure 2 and 5), originating from the in-plane vibrations of aromatic side chains. These modes serve as useful vibrational markers in peptides and proteins. For instance, we can mention that the Raman spectra obtained from somatostatin, a 14-mer peptide hormone containing three Phe and one Trp residues in its chain, reported in paper V of this series,48 are dominated by the intense bands arising from these AAs. (iii) The common feature of all the AAs with an aromatic ring, i.e., His,32 Phe, Tyr, and Trp, is their side-chain conformational flexibility thanks to the variation of _1 and _2 torsion angles (Figure 1). As evidenced by quantum mechanical calculations, their side chain can sweep a large space, rendering possible their interactions with the environment. Especially, water molecules, through their interactions with these AAs, seem

IV. Concluding Remarks Our main conclusions can be summarized as follows:

(i) Despite the very low water solubility of tyrosine, we could finally record for the first time its Raman and FT-IR spectra in aqueous solutions (Figure 3). This was only made possible at a minimal concentration of 2.3 mM (0.42 mg/ mL), just below the saturation condition of Tyr in aqueous solution. (ii) Phe and Trp give rise to intense Raman bands (Figure 2 and 5), originating from the in-plane vibrations of aromatic side chains. These modes serve as useful vibrational markers in peptides and proteins. For instance, we can mention that the Raman spectra obtained from somatostatin, a 14-mer peptide hormone containing three Phe and one Trp residues in its chain, reported in paper V of this series,48 are dominated by the intense bands arising from these AAs. (iii) The common feature of all the AAs with an aromatic ring, i.e., His,32 Phe, Tyr, and Trp, is their side-chain conformational flexibility thanks to the variation of _1 and _2 torsion angles (Figure 1). As evidenced by quantum mechanical calculations, their side chain can sweep a large space, rendering possible their interactions with the environment. Especially, water molecules, through their interactions with these AAs, seem to facilitate the side-chain conformational transitions by lowering the energy barriers separating different conformers. (iv) Theoretical calculations could also help us to better understand the interaction of water molecules with these AAs. Especially, solvent molecules can stabilize their interactions by pointing one of their hydrogens toward the aromatic ring; see, for instance, graphic representations of g-g+ conformers in Phe + 5H2O (Figure 7), g-g- and g-g+ conformers in Tyr + 7H2O (Figure 8), as well as g+g- conformer in Trp + 6H2O (Figure 9). This special manner of interaction of a proton with an aromatic ring seems to be interesting and leads us to emphasize, for instance, the previously published results on helical stabilization observed upon lowering pH in the peptide chains containing Trp and His residues located at i and i + 4 positions, respectively.49 In fact, by decreasing pH toward acidic values, where His ring is protonated on both of its nitrogens, 32 one could expect a better interaction of the protonated His with the Trp aromatic ring found in its proximity due to the helical conformation of a peptide chain. Acknowledgment. This work was granted access to the HPC resources of CINES (Montpellier, France) under the allocation 2010-c2010075065 made by GENCI (Grand Equipement National de Calcul Intensif). Numerical calculations on geometrical and vibrational properties of aromatic amino acids were realized on the Jade (SGI) supercomputing network installed in CINES. Supporting Information Available: Vibrational spectra of tyrosine in solid and heterogeneous phases (Figure S1), as well as atomic Cartesian coordinates of the 12 low-energy conformers displayed in Figures 7-9 (see also Table 4), obtained by full geometry optimization in the presence of explicit solvent, are provided. This material is available free of charge via the Internet at http://pubs.acs.org.

IV. Observaciones finales Las conclusiones principales se pueden resumir de la siguiente manera: (i) A pesar de la baja solubilidad en agua de la tirosina, que finalmente podría registrar por primera vez su Raman y FT-IR espectros en soluciones acuosas (Figura 3). Esto sólo se hizo

posible a una concentración mínima de 2,3 mm (0,42 mg / mL), justo debajo de la condición de saturación de Tyr en disolución acuosa solución. (ii) Phe y Trp dar lugar a intensas bandas de Raman (Figura 2 y 5), procedentes de las vibraciones en el plano de laterales aromáticas cadenas. Estos modos de servir como marcadores de vibración útil péptidos y proteínas. Por ejemplo, podemos mencionar que la Espectros Raman obtenidos a partir de la somatostatina, un péptido de 14-mer la hormona que contiene tres residuos de Phe y Trp uno en su cadena, informó en V de papel de esta serie, 48 están dominados por la intensa bandas que surgen de estos AA. (iii) La característica común de todos los miembros de AA con un aromático anillo, es decir, Su, de 32 años Phe, Tyr, Trp y, es su lado de la cadena de conformación flexibilidad gracias a la variación de la torsión y _1 _2 ángulos (Figura 1). Como se evidencia por la mecánica cuántica cálculos, su cadena lateral puede barrer un gran espacio, lo que hace posible su interacción con el medio ambiente. sobre todo, las moléculas de agua, a través de sus interacciones con los miembros de AA, parece para facilitar las transiciones conformacionales de cadena lateral mediante la reducción de las barreras de energía que separa confórmeros diferentes. (iv) Los cálculos teóricos también nos puede ayudar a una mejor comprender la interacción de las moléculas de agua con estos miembros de AA. En especial, las moléculas del disolvente puede estabilizar sus interacciones señalando uno de sus átomos de hidrógeno hacia el anillo aromático; ver, por ejemplo, representaciones gráficas de g-g + confórmeros en Phe + 5H2O (Figura 7), gg-y g-g + confórmeros en Tyr + 7H2O (Figura 8), así como g + g-conformación de Trp + 6H2O (Figura 9). Esta forma especial de interacción de un protón con un anillo aromático parece ser interesante y nos lleva a destacar, por ejemplo, los resultados publicados anteriormente en la hélice de estabilización observó a bajar el pH en las cadenas peptídicas que contienen Trp y sus residuos ubicado en la I y la I + posiciones 4, respectively.49 De hecho, por la disminución del pH hacia valores ácidos, donde Su anillo es protonado en sus dos átomos de nitrógeno, de 32 años se podría esperar una mejor interacción del haz de His protonadas con el PRT anillo aromático se encuentran en su proximidad, debido a la hélice conformación de una cadena de péptidos. Acuse de recibo. Este trabajo ha sido concedido el acceso a la HPC recursos de CINES (Montpellier, Francia) en la asignación 2010-c2010075065 hecha por Genci (Grand Equipement Nacional de Calcul Intensif). Cálculos numéricos en geometría y las propiedades vibracionales de los aminoácidos aromáticos se realizaron en la red de supercomputación Jade (SGI) instalado en CINES. Información de apoyo disponible: los espectros de vibración de tirosina en las fases sólida y heterogénea (Figura S1), así como atómicas coordenadas cartesianas de los 12 bajo consumo de energía confórmeros muestra en las figuras 7.9 (véase cuadro 4), obtenido por completo optimización de la geometría en la presencia explícita de solvente, se

proporcionado. Este material está disponible de forma gratuita a través de la Internet en http://pubs.acs.org.

Prasad L. Polavarapu · Chunxia Zhao

Vibrational circular dichroism: a new spectroscopic tool for biomolecular structural determination Fresenius J Anal Chem (2000) 366 :727–734 © Springer-Verlag 2000 Received: 31 August 1999 / Revised: 2 November 1999 / Accepted: 14 November 1999

6 Conclusions Distinct spectra-structure correlations have been found betwen the observed VCD spectra and molecular structures of a variety of biomolecular systems. These correlations make the VCD spectroscopy a powerful structural tool. The commercial developments of VCD instruments, and of software for quantum mechanical VCD predictions, made it much easier now, for synthetic chemists, pharmaceutical chemists and structural biologists, to practise the VCD spectroscopy routinely. Acknowledgments We are grateful to NSF (CHE9707773) and Vanderbilt University for grant support. We thank James R. McBride for recording the spectrum of poly(L-lysine) and Dr. P. K. Bose for recording the spectra of oligosaccharides.

Prasad L. Polavarapu • Chunxia Zhao Dicroísmo circular vibracional: un instrumento espectroscópico nuevo para la determinación estructural de biomoléculas Fresenius anal J Chem (2000) 366 :727-734 © Springer-Verlag 2000 Recibido: 31 agosto 1999 / Revisado: 02 de noviembre 1999 / Aceptado el 14 de noviembre 1999

6 Conclusiones Distinta estructura de los espectros de las correlaciones se han encontrado Transcurrirá los espectros observados VCD y las estructuras moleculares de una variedad de sistemas biomoleculares. estas correlaciones realizar la espectroscopia VCD un potente estructurales herramienta. El desarrollo comercial de los instrumentos de VCD, y de software para las predicciones de la mecánica cuántica VCD, hizo mucho más fácil ahora, para los químicos sintéticos, productos farmacéuticos químicos y biólogos estructurales, para practicar el VCD espectroscopia de forma rutinaria. Agradecimientos Agradecemos a NSF (CHE9707773) y La Universidad de Vanderbilt de apoyo financiero. Damos las gracias a James R. McBride para el registro del espectro de poli (L-lisina) y el Dr. PK Bose para registro de los espectros de oligosacáridos.

Vibrational circular dichroism: Chiroptical analysis of biomolecules Tohru Taniguchi, Nobuaki Miura, Shin-Ichiro Nishimura and Kenji Monde Division of Biological Sciences, Graduate School of Science, Frontier Research Center for Post-genomic Science and Technology, Hokkaido University, Kita-ku, Sapporo, Japan

Concluding remarks VCD, a new chiroptical spectroscopy method, has recently undergone rapid instrumental and theoretical development to become one of the most efficient analytical tools available to study the chirality of small molecules aswell as macromolecules. As we have illustrated in the examples including plant metabolites, proteins, and carbohydrates, VCD is a useful technique for analyses of natural products. This paper highlights the application of VCD methods to the structural study of carbohydrates. The scope of applications for VCD has expanded to include analysis of biomacromolecules from proteins to nucleic acids. Although a requirement for relatively large sample quantity or long scannig time currently limit VCD studies, especially for rare or labile natural compounds, further development of VCD instrumentation, methods, and compound databases holds the potential to overcome current limitations in approaching some VCD analytical applications and will likely increase popular use and accessability to these techniques.

Dicroísmo circular vibracional: el análisis de biomoléculas Chiroptical Tohru Taniguchi, Miura Nobuaki, Nishimura Shin-Ichiro y Kenji Monde División de Ciencias Biológicas, Facultad de Ciencias, Centro de Investigación de la Frontera post-genómica Ciencia y Tecnología, La Universidad de Hokkaido, Kita-ku, Sapporo, Japón observaciones finales VCD, un nuevo método de espectroscopia chiroptical, recientemente ha experimentado un rápido desarrollo instrumental y teórica para convertirse en una de las herramientas disponibles más eficientes de análisis para estudiar la quiralidad de las moléculas pequeñas, así como macromoléculas. Como hemos ilustrado en los ejemplos incluidos metabolitos vegetales, proteínas y carbohidratos, VCD es un técnica útil para el análisis de los productos naturales. En este documento destaca la aplicación de los métodos de VCD a los problemas estructurales estudio de los hidratos de carbono. El alcance de las solicitudes de VCD se ha ampliado para incluir el análisis de biomacromoléculas de las proteínas con los ácidos nucleicos. A pesar de la exigencia de muestra relativamente grande cantidad o el tiempo scannig tiempo actualmente límite de los estudios VCD, especialmente para los naturales raros o lábiles compuestos, el desarrollo de la instrumentación VCD, métodos y bases de datos compuesto tiene el potencial de superar las limitaciones actuales para acercarse a algunos VCD

aplicaciones analíticas y es probable que aumente el uso popular y accesibilidad a estas técnicas.

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PES calculated along the D6 (C8-C7-C4-C3) and d21 (o24-c10-c1-c2) dihedral angle at B3LYP/ 6-31G** and B3LYP/ cc-pVDZ level.

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Keywords: Biomolecules / Carbohydrates / Secondary structure / Vibrational circular dichroism /

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Received: March 1, 2004; accepted: April 13, 2004

Vibrational circular dichroism: Chiroptical analysis of biomolecules Tohru Taniguchi, Nobuaki Miura, Shin-Ichiro Nishimura and Kenji Monde Division of Biological Sciences, Graduate School of Science, Frontier Research Center for Post-genomic Science and Technology, Hokkaido University, Kita-ku, Sapporo, Japan

Theory of VCD Chiral molecules respond differently to left versus right circularly polarized radiation due to diastereomeric interaction. The measurements of this differential interaction relate to what is known as optical activity. The most familiar measurements are optical rotation, or optical rotatary dispersion when measured as a function of wavelength, and electronic circular dichroism (ECD). The electronic transitions of a chiral molecule give rise to circular dichroism (CD) in the visible ultraviolet (VIS-UV) spectral region. ECD spectrometers have been widely available for routine measurements since the early 1960s, whereas the measurement of CD in vibrational transitions, i. e., VCD, has been available only for a limited number of researchers until the late 1990s. The relationship between VCD and infrared (IR) absorption is the same as that between ECD and UV absorption (Fig. 1). VCD measures the differential absorption of left versus right circularly polarized IR incident light in the molecular vibrational transition.

i 2004 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim www.mnf-journal.de

MNF Educcattiion Vibrational circular dichroism: Chiroptical analysis of biomolecules Tohru Taniguchi, Nobuaki Miura, Shin-Ichiro Nishimura and Kenji Monde Division of Biological Sciences, Graduate School of Science, Frontier Research Center for Post-genomic Science and Technology, Hokkaido University, Kita-ku, Sapporo, Japan Keywords: Biomolecules / Carbohydrates / Secondary structure / Vibrational circular dichroism /

Received: March 1, 2004; accepted: April 13, 2004 Correspondence: Kenji Monde, Division of Biological Sciences, Graduate School of Science, Frontier Research Center for Post-genomic Science and Technology, Hokkaido University, Kita-ku, Sapporo

001-0021, Japan E-mail: [email protected] Fax: +81-11-706-9041 (or -9042) Abbreviations: ECD, electronic circular dichroism; IR, infrared; VCD, vibrational circular dichroism 246 T. Taniguchi et al. DOI 10.1002/mnfr.200400007 Mol. Nutr. Food Res. 2004, 48, 246 – 254 Mol. Nutr. Food Res. 2004, 48, 246 – 254 Vibrational CD: Chiroptical analysis of biomolecules

_A = AL – AR (1) where AL and AR are absorbances for left and right circularly polarized radiation, respectively. The ordinary IR absorption, A, is given by the average of AL and AR, namely, A = 1/2 (AL + AR) (2) and A = – log10 (I/I0) (3) where I and I0 are the average transmission with and without the sample. Assuming the Beer-Lambert law is valid and in the case when the pathlength and concentration are known, VCD can be expressed in terms of the difference in molar absorptivity as _e = eL – eR =_A/cl (4) where c is the molar concentration and l is the pathlength in cm. In this paper, measured VCD and IR spectra are expressed by_e and e, respectively. The anisotropy ratio, g, the quotient of the intensity of VCD to that of IR, is another significant parameter which is also specified in publications. g =_e/e = _A/A (5) The anisotropy ratio g, which is meaningful between ~10–3 to 10–5, could be a criterion for judging whether a vibrational mode can cause large or small VCD absorption. For instance, C=C=C antisymmetric stretching of a chiral allene shows strong VCD at around 1945 cm–1 in spite of relatively small corresponding IR absorbance (g = ~10–3) [6], while C=O stretching of 3-hydroxyoxindole at around 1730 cm–1 has intense IR absorbance but small VCD (g =~10–5; see Fig. 3). The question of whether a vibrational mode exhibits large VCD or not is ultimately ascribed to the magnitude and direction of both electronic- and magneticdipole transition moments [7, 8]. The anisotropy ratio g is also important in terms of analytic calculations because it relates theoretical spectra to experimental ones by the following equation: g =_A/A = 4R/D (6) where R and D are called rotatory strength and dipole strength, respectively. For a small molecule, both R and D can be calculated using Gaussian 98 or 03 [9]. A more complicated theoretical background of VCD is not addressed here, but more detailed descriptions are offered in other publications [7, 8]. Teoría de VCD

Las moléculas quirales responden de manera diferente a la izquierda contra la derecha circularmente radiación polarizada debido a la interacción diastereoisómeros. Las medidas de esta interacción diferencial se relacionan con lo que se conoce como actividad óptica. Los más conocidos medidas son la rotación óptica, o la dispersión óptica rotatary cuando se mide en función de la longitud de onda, y dicroísmo circular electrónica (ECD). Las transiciones electrónicas de una molécula quiral dar lugar a dicroísmo circular (CD) en el ultravioleta-visible (VIS-UV) región espectral. Espectrómetros de ECD han estado disponibles para la rutina

mediciones desde la década de 1960, mientras que la medición de CD en las transiciones vibracionales, i. e., VCD, ha sido disponible sólo para un número limitado de investigadores hasta que el finales de 1990. La relación entre el VCD y la absorción de infrarrojos (IR) es la misma que existe entre la absorción de la primera infancia y UV (Fig. 1). VCD mide la absorción diferencial de la izquierda contra la derecha polarizada circularmente IR luz incidente en el transición de vibración molecular. i 2004 Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim www.mnf-journal.de MNF Educcattiion Dicroísmo circular vibracional: el análisis de biomoléculas Chiroptical Tohru Taniguchi, Miura Nobuaki, Nishimura Shin-Ichiro y Kenji Monde División de Ciencias Biológicas, Facultad de Ciencias, Centro de Investigación de la Frontera post-genómica Ciencia y Tecnología, La Universidad de Hokkaido, Kita-ku, Sapporo, Japón Palabras clave: Biomoléculas / carbohidratos / Secundaria estructura circular / vibración dicroísmo / Recibido: 01 de marzo 2004; aceptado: 13 de abril 2004 Correspondencia: Kenji Monde, División de Ciencias Biológicas, Escuela de Graduados de Ciencias, Centro de Investigación de la Frontera postgenómica Ciencia y Tecnología, la Universidad de Hokkaido, Kita-ku, Sapporo 001-0021, Japón E-mail: [email protected] Fax: +81-11-706-9041 (o -9042) Abreviaturas: ECD, electrónica dicroísmo circular, IR, infrarrojo; VCD, dicroísmo circular vibracional 246 T. Taniguchi et al. DOI 10.1002/mnfr.200400007 Mol. Nutr. Alimentos Res. 2004, 48, 246 a 254 Mol. Nutr. Alimentos Res. 2004, 48, 246 a 254 CD vibración: el análisis de biomoléculas Chiroptical _A = AL - AR (1) en AL y AR son las absorbancias de izquierda y derecha circularmente radiación polarizada, respectivamente. La corriente de absorción de IR, A, está dada por el promedio de AL y AR, es decir, A = 1 / 2 (AL + AR) (2) y A = - log10 (I/I0) (3) y donde I0 es el medio de transmisión con y sin la muestra. Suponiendo que la ley de Beer-Lambert es válida y en el caso de que el paso de luz y la concentración son conocidos, VCD se pueden expresar en términos de la diferencia en el molar

capacidad de absorción como _e = EL - ER = _A / cl (4) donde c es la concentración molar y l es el paso de luz en cm. En este trabajo, medida VCD y espectros IR se expresa by_e y E, respectivamente. La relación de anisotropía, g, el cociente de la intensidad de VCD a la del IR, es otro parámetro importante que también se se especifica en las publicaciones. g = _e / e = _A / A (5) La anisotropía relación de g, que es significativa entre 3.10 ~ a 5.10, podría ser un criterio para juzgar si una vibración modo puede causar la absorción de VCD grande o pequeño. Para ejemplo, C = C = C antisimétrica estiramiento de un quiral aleno muestra fuertes VCD en torno a 1945 cm-1 a pesar de absorbancia correspondiente relativamente pequeño IR (g = ~ 10.3) [6], mientras que C = O se extiende de 3-hydroxyoxindole en torno a 1730 cm-1 tiene una intensa absorción de infrarrojos, pero pequeñas VCD (G = ~ 10.5, ver Fig. 3).. La cuestión de si una vibración muestra el modo de grandes VCD o no, es en última instancia, atribuye a la magnitud y dirección de ambas electrónicos y magnéticos, momentos dipolares de transición [7, 8]. La relación de anisotropía g también es importante en términos de cálculos analíticos, porque se relaciona con los espectros teóricos a los experimentales por el texto siguiente ecuación: g = _A / A = 4R / D (6) en I + D se llama fuerza rotatoria y el dipolo fuerza, respectivamente. Para que una molécula pequeña, tanto en I y D se puede calcular utilizando Gauss 98 o 03 [9]. A más complicado base teórica de VCD no se trata aquí, pero las descripciones más detalladas se ofrecen en otros publicaciones [7, 8].

Figure 5. IR absorption of simple carbohydrates and the measurement conditions. Detector: InSb detector and MCT detector have to be adopted for the measurement of the hydrogen stretching region and the fingerprint region, respectively. Cell: representative two cell windows are shown. The solid lines indicate the available spectral region but the cell windows have a little absorption in the dotted zones. If a data in the dotted region is required, a solvent absorption has to be reduced as far as possible. Solvent: representative three solvents, which are sufficiently polar to dissolve a carbohydrate sample, are shown. They have little or no absorption in the solid lines but an extension of pathlength may preclude VCD measurement in the dotted regions. Vibration: simple carbohydrates show IR absorption, therefore VCD signals, in the regions displayed by the solid line. Many complicated vibrations exist in the fingerprint región

Figura 5. IR absorción de hidratos de carbono simples y las condiciones de medida. Detector: InSb detector y detector MCT tienen que ser adoptadas para la medición de la región de hidrógeno de estiramiento y la región de huellas digitales, respectivamente. Celular: representante dos ventanas de las celdas se muestran. Las líneas continuas indican la región del espectro disponible, pero las ventanas de las celdas tienen un poco absorción en las zonas de puntos. Si los datos de la región se requiere de puntos, una absorción de disolvente tiene que ser reducido tanto como sea posible. Solvente: el representante de tres solventes, que son lo suficientemente polar para disolver una muestra de hidratos de carbono, se muestran. ellos tienen poca o ninguna absorción en las líneas continuas, sino una extensión de paso de luz puede impedir la medición de puntos en el VCD. Concluding remarks VCD, a new chiroptical spectroscopy method, has recently undergone rapid instrumental and theoretical development to become one of the most efficient analytical tools available to study the chirality of small molecules aswell as macromolecules.

As we have illustrated in the examples including plant metabolites, proteins, and carbohydrates, VCD is a useful technique for analyses of natural products. This paper highlights the application of VCD methods to the structural study of carbohydrates. The scope of applications for VCD has expanded to include analysis of biomacromolecules from proteins to nucleic acids. Although a requirement for relatively large sample quantity or long scannig time currently limit VCD studies, especially for rare or labile natural compounds, further development of VCD instrumentation, methods, and compound databases holds the potential to overcome current limitations in approaching some VCD analytical applications and will likely increase popular use and accessability to these techniques.

observaciones finales VCD, un nuevo método de espectroscopia chiroptical, recientemente ha experimentado un rápido desarrollo instrumental y teórica para convertirse en una de las herramientas disponibles más eficientes de análisis para estudiar la quiralidad de las moléculas pequeñas, así como macromoléculas. Como hemos ilustrado en los ejemplos incluidos metabolitos vegetales, proteínas y carbohidratos, VCD es un técnica útil para el análisis de los productos naturales. En este documento destaca la aplicación de los métodos de VCD a los problemas estructurales estudio de los hidratos de carbono. El alcance de las solicitudes de VCD se ha ampliado para incluir el análisis de biomacromoléculas de las proteínas con los ácidos nucleicos. A pesar de la exigencia de muestra relativamente grande cantidad o el tiempo scannig tiempo actualmente límite de los estudios VCD, especialmente para los naturales raros o lábiles compuestos, el desarrollo de la instrumentación VCD, métodos y bases de datos compuesto tiene el potencial de superar las limitaciones actuales para acercarse a algunos VCD aplicaciones analíticas y es probable que aumente el uso popular y accesibilidad a estas técnicas.

Experimental methods There are currently a few commercially available factoryaligned Fourier transform (FT)-VCD instruments. Chiralir, released 1997 from Bomem/BioTools, Inc., is the most widespread of these. Also, JV-2001, provided by JASCO Co. since 2001, has been popular. Both VCD optical systems can be described by the same simple block diagram (Fig. 2). In both systems, IR radiation from a light source first directs through a Michelson interferometer and then passes through an optical filter to isolate the spectral region of interest. The IR beam continues through a linear polarizer that defines a single state of polarization and then on to a ZeSe photoelastic modulator (PEM) that modulates the polarization between left- and right-circularly polarized states. A chiral sample in an appropriate IR sample cell is placed directly after the PEM and the beam is focused with 247

i 2004 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim www.mnf-journal.de Figure 1. Type of radiation and corresponding CD. VCD is considered as an extended version of conventional ECD. The advantage of VCD comes from the spectroscopic detail of IR with the

stereochemical sensitivity of CD. T. Taniguchi et al. Mol. Nutr. Food Res. 2004, 48, 246 – 254

a lens to a liquid nitrogen-cooled detector. The detector signal is processed by subsequent electronics to yield IR and VCD spectra. In both spectrometers, detector sensitivity (or polarizer transmittance) prohibits measurements in the spectral region below 750 cm–1. Besides these two VCD instruments, other companies (e. g., Bruker) provide VCD accessories to be used in conjugation with FT-IR spectrometers. To examine the accuracy of a VCD instrument, optically pure a-pinene or a CCl4 solution of camphor are widely used as standards because their VCD spectra can be obtained at high signal-to-noise (S/N) ratios in relatively short scan times. The latter is particularly a good standard for the hydrogen stretching and the carbonyl stretching region. If a pair of enantiomers does not adequately exhibit sufficiently opposite VCD spectral patterns, a raw VCD can be corrected by the VCD spectrum of its enantiomer. A halfdifference spectrum is also calculated simply to obtain a more accurate VCD spectrum: _A(S)corrected = 1/2 [_A(S)raw – _A(R)raw] (7) However, enantiomer correction can be performed only in the case where both enantiomers are available. Therefore, most sugars and proteins are inaccessible by this approach. An alternative and general way to correct a spectrum is solvent correction where the solvent spectrum is subtracted from the raw sample spectrum: _Acorrected =_Asample – _Asolvent (8) Unless the sample is neat liquid, an IR spectrum also has to be corrected for the IR spectrum of the solvent. To obtain a VCD spectrum with higher accuracy in the desired wavenumber region, a solvent should be carefully selected as well as concentration, sample cell, and instrumental conditions. CCl4 or CDCl3 have been widely used for small chiral molecules but they are not suitable for most biomolecules that are intrinsically hydrophilic. Instead, water, deuterium oxide or DMSO-d6 have been frequently chosen to analyze biomolecules. These solvents might form hydrogen bonds with the sample molecules and then affect the VCD shapes, in part, by altering sample conformation. Such solvent contribution is not always undesired and, in practice, many biological molecules have been measured using such solvents [10]. However, in case the solvent contribution must necessarily be supressed, VCD can be measured in the solid state. Thus, some solid state VCD spectra for peptides have been measured in halocarbon oil [11], and VCD spectra for carbohydrates in KBr were recently reported [12]. When water or deuterium oxide is selected as a solvent, which is uncommon in a normal IR measurement, an ordinary NaCl or KBr sample cell must be avoided. This is typically replaced by a CaF2 or BaF2 sample cell. Though a little expensive, these are used in almost all VCD measurements. CaF2 windows preclude measurement below 1000 cm–1. However, BaF2 affords a wider spectrum up to ~750 cm–1 (see Fig. 5) but care must be taken regarding storing and handling because of the slight deliquescence of BaF2. In fact, solubilities of NaCl, BaF2, and CaF2 in 100 g H2O at 08C are 35 g, ~0.2 g, and ~0.002 g, respectively. IR absorbance adjusted to around 0.4 is optimal for VCD measurement, which will need a sample on the mg order. The high sample requirement is unfavorable for the measurement of rare biomolecules. Another disadvantage of

VCD is, due to the small magnitude of VCD signals, the necessity for longer collection time, usually 1 h or more. The aforementioned a-pinene is an exception. It offers VCD spectra in sufficiently high S/N ratios even in only 5 min scanning time. The problem of low S/N is being improved through new instrumental developments [13].

Métodos experimentales Actualmente hay un factoryaligned pocos disponibles en el mercado Transformada de Fourier (FT)-VCD instrumentos. Chiralir, 1997 Lanzamiento de Bomem / BioTools, Inc., es el más generalizada de estos. Además, JV-2001, proporcionada por JASCO Co. desde 2001, ha sido muy popular. Ambos VCD sistemas ópticos puede ser descrito por el diagrama de bloques simples mismo (Fig. 2). En ambos sistemas, la radiación IR de una fuente de luz primero dirige a través de un interferómetro de Michelson y pasa a través de un filtro óptico para aislar a la región espectral de interés. El haz de infrarrojos sigue a través de un polarizador lineal que define un solo estado de polarización y luego a un ZeSe fotoelástica modulador (PEM) que modula la polarización entre izquierda y derecha de polarización circular los estados. Una muestra quiral en una celda de muestra adecuado IR es colocan directamente después del PEM y el haz se concentra en 247 i 2004 Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim www.mnf-journal.de Figura 1. Tipo de radiación y el CD correspondiente. VCD es considerado como una versión extendida de ECD convencionales. La ventaja de VCD viene de los detalles de espectroscopia de infrarrojos con el sensibilidad estereoquímica de CD. T. Taniguchi et al. Mol. Nutr. Alimentos Res. 2004, 48, 246 a 254 una lente a un nitrógeno líquido refrigerado por detector. La señal del detector es procesada por la electrónica posterior al rendimiento de IR y VCD espectros. En ambos espectrómetros, analizadores de la sensibilidad del detector (o transmisión polarizador) prohíbe las mediciones en el región del espectro por debajo de 750 cm-1. Además de estos dos VCD instrumentos, otras compañías (por ejemplo, Bruker) proporcionan VCD accesorios que se utilizan en la conjugación con los espectrómetros FT-IR. Para examinar la precisión de un instrumento de VCD, ópticamente puro a-pineno o una solución de alcanfor CCl4 son ampliamente utilizados como patrones, porque sus espectros VCD puede ser obtenidos en una alta relación señal-ruido (S / N) en relativamente cortos tiempos de análisis. Esto último es particularmente un buen nivel para el hidrógeno se extiende y se extiende el carbonilo región. Si un par de enantiómeros no muestra suficientemente adecuada

frente a los patrones espectrales VCD, VCD materia prima puede ser corregido por el espectro de VCD de su enantiómero. A halfdifference espectro también se calcula simplemente para obtener una más precisa VCD espectro: ? A (S) corregido = 1 / 2 [A (S) en bruto -? A (R) en bruto] (7) Sin embargo, la corrección de enantiómero se puede realizar sólo en el caso de que ambos enantiómeros están disponibles. Por lo tanto, la mayoría de los azúcares y las proteínas son inaccesibles por este enfoque. Una forma alternativa y en general para corregir un espectro es solvente corrección que se resta del espectro solvente del espectro de la muestra en bruto: ? Acorrected = ASAMPLE - Asolvent (8) A menos que la muestra es líquido puro, un espectro de IR también tiene que ser corregida por el espectro IR del disolvente. Para obtener un espectro VCD con mayor precisión en la número de onda deseada región, un solvente debe ser cuidadosamente seleccionada, así como la concentración, la muestra de células, e instrumental condiciones. CCl4 CDCl3 o han sido ampliamente utilizados para las pequeñas moléculas quirales, pero no son adecuados para la mayoría biomoléculas que son intrínsecamente hidrofílico. En su lugar, agua, óxido de deuterio o DMSO-d6 han sido con frecuencia elegido para analizar las biomoléculas. Estos disolventes pueden formar enlaces de hidrógeno con las moléculas de la muestra y después afectan las formas VCD, en parte, mediante la alteración de la conformación de la muestra. Contribución solvente no siempre es no deseado y, en la práctica, muchas de las moléculas biológicas se han medido el uso de disolventes tales [10]. Sin embargo, en caso de que la contribución de disolvente necesariamente debe ser suprimida, VCD se puede medir en estado sólido. Así, algunos en estado sólido VCD espectros para los péptidos se han medido en aceite de halocarbonos [11], y Espectros de VCD de hidratos de carbono en KBr fueron recientemente reportado [12]. Cuando el óxido de deuterio o de agua se ha seleccionado como solvente, cual es poco común en una medición normal IR, una ordinaria NaCl o KBr células de la muestra debe ser evitado. Normalmente, esto se sustituida por una célula de la muestra CaF2 o BaF2. Aunque un poco caros, estos se utilizan en casi todas las mediciones VCD. CaF2 ventanas impiden la medición por debajo de 1000 cm-1. Sin embargo, BaF2 ofrece un espectro más amplio de hasta ~ 750 cm-1 (Ver fig. 5), pero se debe tener cuidado en relación con el almacenamiento y la manipulación, debido a la delicuescencia ligera BaF2. En De hecho, la solubilidad de NaCl, BaF2, y CaF2 en 100 g H2O 08C es de 35 g, aproximadamente 0.2 g, y ~ 0.002 g, respectivamente. Absorción IR ajustado a alrededor de 0,4 es óptimo para VCD medición, que tendrá una muestra en el orden mg.

El requisito de la muestra de alta es desfavorable para la medición de biomoléculas raro. Otra desventaja de los VCD es, debido a la pequeña magnitud de las señales de VCD, de la necesidad de tiempo de recogida de más tiempo, por lo general 1 hora o más. Lo anterior, a-pineno es una excepción. Ofrece VCD espectro lo suficientemente alto en S / N, incluso en un solo 5 minutos el tiempo de análisis. El problema de la baja S / N se mejorado a través de nuevos desarrollos instrumentales [13].

Las aplicaciones de los espectros de vibración son numerosas, especialmente su aplicación en el conocimiento de la estructura molecular. Una gran cantidad de obras que tratan de las aplicaciones de los espectros IR y Raman se encuentran en la literatura. Por el contrario, las aplicaciones de VCD y ROA son relativamente nuevos. En las dos últimas décadas, los esfuerzos se han centrado en el estudio de los espectros experimentales de estructura y relación en el desarrollo de un marco teórico que pueda explicar y predecir las características experimentales. Hoy en día, es bien sabido que cuando la información derivada de la absorción de corriente vibracional Raman y estudios se complementan con la de los espectros de vibración actividad óptica, los detalles estructurales derivados tienen mayor validez. Con el fin de obtener los espectros de VCD y el ROA de un sistema químico, este sistema tiene que exhiben quiralidad molecular o supramolecular. Debido a esto, esta técnica tiene su aplicación más importante en el campo de las biomoléculas.

2. Aplicaciones de las espectroscopias sensibles a la quiralidad VCD y ROA. Proporcionar una breve descripción de los fundamentos de las técnicas VCD y ROA y la información que se puede obtener con su aplicación. Comentar un par de ejemplos de su aplicación al estudio de biomoléculas, las ventajas y desventajas que estas técnicas ofrecen.

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(4) Sergio Abbate, France Lebon, Giovanna Longhi, Francesca Fontana, Tullio Caronna, David A. Lightner, “Experimental and calculated vibrational and electronic circular dichroism spectra of 2-Br-hexahelicene”, Phys. Chem. Chem. Phys. 2009, 11, 9039–9043. (5) E. Deplazes, W. van Bronswijk, F. Zhu, L. D. Barron, S. Ma, L. A. Nafie, K. J. Jalkanen, “A combined theoretical and experimental study of the structure and vibrational absorption, vibrational circular dichroism, Raman and Raman optical activity spectra of the L-histidine zwitterions”, Theor. Chem. Account 2008, 119, 155–176. (6) Shi Qiu, Guanna Li, Peng Liu, Changhao Wang, Zhaochi Feng, Can Li, “Chirality transition in the epoxidation of (α)-pinene and successive hydrolysis studied by Raman optical activity and DFT”, Phys. Chem. Chem. Phys. 2010, 12, 3005–3013. (7) K. J. Jalkanen, I. M. Degtyarenko, R. M. Nieminen, X. Cao, L. A. Nafie, F. Zhu, L. D. Barron, “Role of hydration in determining the structure and vibrational spectra of L-alanine and N-acetyl L-alanine Nı-methylamide in aqueous solution: a combined theoretical and experimental approach”, Theor. Chem. Account 2008, 119, 191–210. (8) O. McConnell, Y. He, L. Nogle, A. Sarkahjan, “Application of Chiral Technology in a Pharmaceutical Company. Enantiomeric Separation and Spectroscopic Studies of Key Asymmetric Intermediates Using a Combination of Techniques. Phenylglycidols”, CHIRALITY 2007, 19, 716–730. UNIVERSIDAD DE JAÉN Facultad de Ciencias Experimentales Dpto. de Química Física y Analítica Campus

“Las Lagunillas”, E-23071 Jaén (España / Spain), Tlfno: +34-953 21 33 60, Fax: +34-953 21 29 40 e-mail:[email protected]

(7) Algunos autores importantes en este campo son: L. A. Nafie, L. D. Barron, T. A. Keiderling, P. L. Polavalapu, T. Buffeteau, S. Abbate, J. Kapitan, etc.

2004 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim www.mnf-journal.de

MNF Educcattiion Vibrational circular dichroism: Chiroptical analysis of biomolecules Tohru Taniguchi, Nobuaki Miura, Shin-Ichiro Nishimura and Kenji Monde Division of Biological Sciences, Graduate School of Science, Frontier Research Center for Post-genomic Science and Technology, Hokkaido University, Kita-ku, Sapporo, Japan Keywords: Biomolecules / Carbohydrates / Secondary structure / Vibrational circular dichroism /

Received: March 1, 2004; accepted: April 13, 2004 Correspondence: Kenji Monde, Division of Biological Sciences, Graduate School of Science, Frontier Research Center for Post-genomic Science and Technology, Hokkaido University, Kita-ku, Sapporo 001-0021, Japan E-mail: [email protected] Fax: +81-11-706-9041 (or -9042) Abbreviations: ECD, electronic circular dichroism; IR, infrared; VCD, vibrational circular dichroism 24

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Introduction General aspects Chirality is a fundamental feature of all living organisms at the molecular level as well as on the macroscopic scale. The high degree of preference for only one of two possible mirror images in nature, such as L-amino acids or D-sugars, often called biological homochirality, is a puzzling and not yet fully understood phenomenon [1]. The chirality of some known compounds can be “felt” by smelling or tasting small amounts of them. As often exemplified by the sodium salt of glutamic acid or the hydrocarbon limonene, many chiral odorants or flavor compounds cause different sensory properties depending on their stereochemistry. This is because the receptors are proteins, constituted of chiral amino acids, which interact with enantiomers to form diastereomeric molecular complexes that result in various smells and tastes [2]. Stereospecific differences have more serious consequences in pharmacology, as shown in studies on enantiomeric pharmaceuticals including thalidomide or ibuprofen [3, 4]. The use of a chiroptical technique, except for X-ray crystallography, comprise the sole method to non empirically determine the absolute configuration of a compound [5]. Xray scattering based on the Bijvoet method has been quite effective in determining chirality, but the requirement that samples be in crystalline form has frequently limited its applicability. On the other hand, the chiroptical methods have an advantage of an accessibility to the samples in a solution. Recently, a new chiroptical method, vibrational circular dichroism (VCD) spectroscopy was developed. VCD measures the circular dichroism in the infrared region usually between 4000 and 750 cm–1. Since the advent of the first commercial VCD instrument in 1997, VCD is becoming one of the most powerful and convenient analytical tools for natural products and biomolecules due to the abundance of spectral information including some well-isolated peaks in the 1800–1500 cm– 1 region. In this paper, we describe some fundamental VCD concepts, instruments, and applications.

Introducción Aspectos generales La quiralidad es una característica fundamental de todos los organismos vivos a nivel molecular, así como en la escala macroscópica. El alto grado de preferencia por sólo una de las dos imágenes especulares posibles en la naturaleza, tales como Laminoácidos o azúcares D, a menudo llamado homoquiralidad biológica, es un fenómeno desconcertante y todavía no se entiende completamente [1]. La quiralidad de algunos compuestos conocidos se pueden "sentir" al oler o probar pequeñas cantidades de ellos. Como suele ejemplificado por la sal sódica del ácido glutámico o el limoneno hidrocarburo, muchos olores o sabores compuestos quirales causar diferentes propiedades sensoriales en función de su estereoquímica. Esto es porque los receptores son proteínas, constituido por quiral aminoácidos, los cuales interactúan con los enantiómeros para formar diastereoméricas complejos moleculares que dan lugar a distintos olores y sabores [2]. Diferencias estereoespecíficos tener consecuencias más graves en la farmacología,

como se muestra en los estudios sobre productos farmacéuticos, incluyendo enantiómeros talidomida o el ibuprofeno [3, 4]. El uso de una técnica chiroptical, excepto por cristalografía de rayos X, comprenden el único método para determinar no empíricamente la configuración absoluta de un compuesto [5]. Dispersión Rayos X, basado en el método Bijvoet ha sido bastante eficaces en la determinación de la quiralidad, pero el requisito de que las muestras de estar en forma cristalina con frecuencia ha limitado su aplicabilidad. Por otro lado, los métodos chiroptical tienen una ventaja de un acceso a las muestras en una solución. Recientemente, un método chiroptical nueva vibración dicroísmo circular (VCD) se desarrolló la espectroscopia. VCD mide el dicroísmo circular en la región infrarroja por lo general entre 4000 y 750 cm-1. Desde la llegada del primer instrumento comercial de VCD en el año 1997, VCD está convirtiendo en uno de las herramientas analíticas más potentes y prácticos de los productos naturales y biomoléculas debido a la abundancia de la información espectral incluyendo algunos picos bien aisladas en el 1800-1500 cm1 región. En este trabajo, se describen algunos de los conceptos fundamentales de VCD, instrumentos y aplicaciones.

Theory of VCD Chiral molecules respond differently to left versus right circularly polarized radiation due to diastereomeric interaction. The measurements of this differential interaction relate to what is known as optical activity. The most familiar measurements are optical rotation, or optical rotatary dispersion when measured as a function of wavelength, and electronic circular dichroism (ECD). The electronic transitions of a chiral molecule give rise to circular dichroism (CD) in the visible ultraviolet (VIS-UV) spectral region. ECD spectrometers have been widely available for routine measurements since the early 1960s, whereas the measurement of CD in vibrational transitions, i. e., VCD, has been available only for a limited number of researchers until the late 1990s. The relationship between VCD and infrared (IR) absorption is the same as that between ECD and UV absorption (Fig. 1). VCD measures the differential absorption of left versus right circularly polarized IR incident light in the molecular vibrational transition.

Figure 1. Type of radiation and corresponding CD. VCD is considered as an extended version of conventional ECD. The advantage of VCD comes from the spectroscopic detail of IR with the stereochemical sensitivity of CD.

Teoría de VCD Las moléculas quirales responden de manera diferente a la izquierda contra la derecha la radiación polarizada circularmente debido a la interacción de diastereoisómeros. Las mediciones de esta interacción diferencial se refieren a lo que se conoce como actividad óptica. Las mediciones más conocidos son la rotación óptica, o dispersión giratoria situada óptica cuando se mide como una función de longitud de onda, y electrónicos dicroísmo circular (ECD). Las transiciones electrónicas de una molécula quiral dar lugar a dicroísmo circular (DC) en el ultravioleta visible (VIS-UV) región espectral. Espectrómetros de DPI han sido ampliamente disponible para las mediciones de rutina desde la década de 1960, mientras que la medición de la CD en las transiciones vibracionales, i. e., VCD, ha estado disponible sólo para un número limitado de investigadores hasta que el finales de 1990. La relación entre VCD y absorción en el infrarrojo (IR) es la misma que entre ECD y absorción UV (fig. 1). VCD mide la absorción diferencial de la luz incidente izquierda contra derecha polarizada circularmente en el IR transición vibracional molecular. _ A = AL – AR (1) where AL and AR are absorbances for left and right circularly polarized radiation, respectively. The ordinary IR absorption, A, is given by the average of AL and AR, namely, A = 1/2 (AL + AR) (2) and A = – log10 (I/I0) (3) where I and I0 are the average transmission with and without the sample. Assuming the Beer-Lambert law is valid and in the case when the pathlength and concentration are known, VCD can be expressed in terms of the difference in molar absorptivity as _e = eL – eR =_A/cl (4) where c is the molar concentration and l is the pathlength in cm. In this paper, measured VCD and IR spectra are expressed by_e and e, respectively. The anisotropy ratio, g, the quotient of the intensity of VCD to that of IR, is another significant parameter which is also specified in publications. g =_e/e = _A/A (5) The anisotropy ratio g, which is meaningful between ~10–3 to 10–5, could be a criterion for judging whether a vibrational mode can cause large or small VCD absorption. For instance, C=C=C antisymmetric stretching of a chiral allene shows strong VCD at around 1945 cm–1 in spite of relatively small corresponding IR absorbance (g = ~10–3) [6], while C=O stretching of 3hydroxyoxindole at around 1730 cm–1 has intense IR absorbance but small VCD (g =~10–5; see Fig. 3). The question of whether a vibrational mode exhibits large VCD or not is ultimately ascribed to the magnitude and direction of both electronic- and magnetic- dipole transition moments [7, 8]. The anisotropy ratio g is also important in terms of analytic calculations because it relates theoretical spectra to experimental ones by the following equation: g =_A/A = 4R/D (6)

where R and D are called rotatory strength and dipole strength, respectively. For a small molecule, both R and D can be calculated using Gaussian 98 or 03 [9]. A more complicated theoretical background of VCD is not addressed here, but more detailed descriptions are offered in other publications [7, 8]. A = AL – AR (1) en AL y AR son las absorbancias de la radiación izquierda y la derecha polarizada circularmente, respectivamente. La corriente de absorción IR, A, está dada por la media de AL y AR, a saber, A = 1/2 (AL + AR) (2) y A = - log10 (I/I0) (3) donde e I0 son la transmisión media con y sin la muestra. Suponiendo que la ley de Beer-Lambert es válida y, en el caso cuando el paso de luz y la concentración son conocidos, VCD puede ser expresada en términos de la diferencia de absortividad molar como _e = EL - ER = _A / cl (4) donde c es la concentración molar y L es la longitud de trayecto en cm. En este trabajo, medida VCD y espectros IR se expresan by_e y E, respectivamente. La relación de anisotropía, g, el cociente de la intensidad de VCD a la de infrarrojos, es otro parámetro importante que también se especifica en las publicaciones. g = _e / e = _A / A (5) La relación de anisotropía g, que es significativa entre ~ 10-3 a 10-5, podría ser un criterio para juzgar si un modo de vibración puede causar la absorción de VCD grande o pequeño. Por ejemplo, C = C = C antisimétrica estiramiento de un aleno quiral muestra fuerte VCD en torno a 1945 cm-1, a pesar de absorbancia correspondiente relativamente pequeño IR (g = ~ 10-3) [6], mientras que C = O estiramiento de 3 -hydroxyoxindole en torno a 1730 cm-1 tiene una intensa absorción de infrarrojos, pero pequeña VCD (g = ~ 10.5;. ver Fig. 3). La cuestión de si un modo de vibración exhibe grandes VCD o en última instancia, no se atribuye a la magnitud y dirección de los dos momentos de transición y electrónicos-dipolo magnético [7, 8]. La relación g anisotropía es también importante en términos de cálculos analíticos porque se refiere a los espectros teórico los experimentales por la siguiente ecuación: g = _A / A = 4R / D (6) donde R y D se denominan fuerza rotatoria y la fuerza dipolo, respectivamente. Para una molécula pequeña, ambos R y D se puede calcular utilizando gaussiana 98 o 03 [9]. Un marco teórico más complicado de VCD no se menciona aquí, pero las descripciones más detalladas se ofrecen en otras publicaciones [7, 8].

Los métodos experimentales En este momento hay una factoryaligned unos pocos disponibles en el mercado Transformada de Fourier (FT)-VCD instrumentos. Chiralir, lanzado en 1997 Bomem / Biotools, Inc., es el más generalizada de estos. Además, JV-2001, proporcionada por JASCO Co. desde 2001, ha sido muy popular. Ambos sistemas ópticos VCD puede ser descrito por el diagrama de bloques simples mismo (Fig. 2). En ambos sistemas, IR radiación procedente de una fuente de luz primero dirige a través de un interferómetro de Michelson y luego pasa a través de un filtro óptico para aislar la región espectral de interés. El haz de infrarrojos continúa a través de un polarizador lineal

que define un estado de polarización y luego a un ZeSe fotoelástico modulador (PEM) que modula la polarización entre izquierda y derecha polarizadas circularmente estados. Una muestra quiral en una celda de muestra adecuado IR es coloca directamente después de la PEM y el haz es enfocado con 247 i 2004 Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim www.mnf-journal.de Figura 1. Tipo de radiación y CD correspondiente. VCD se considera como una versión ampliada de ECD convencional. La ventaja de VCD viene del detalle espectroscópico de IR con el la sensibilidad estereoquímica de CD. T. Taniguchi y col. Mol. Nutr. Resolución de alimentos. 2004, 48, 246 a 254 una lente a un líquido enfriado con nitrógeno detector. La señal del detector es procesada por la electrónica posteriores para dar IR y VCD espectros. En ambos espectrómetros, la sensibilidad del detector (o transmisión polarizador) prohíbe las mediciones en el región espectral por debajo de 750 cm-1. Además de estos dos VCD instrumentos, otras compañías (por ejemplo, Bruker) proporcionan VCD accesorios para ser utilizados en conjugación con FT-IR espectrómetros. Para examinar la precisión de un instrumento de VCD, ópticamente pura a-pineno o una solución de alcanfor CCl4 son ampliamente utilizados como patrones, ya que su espectro de VCD puede ser obtenidos en una alta relación señal a ruido (S / N) en relativamente cortos tiempos de análisis. Esto último es particularmente un buen nivel para el estiramiento de hidrógeno y el estiramiento del carbonilo región. Si un par de enantiómeros no muestran lo suficientemente adecuada frente a los patrones espectrales VCD, VCD materia prima puede ser corregida por el espectro de VCD de su enantiómero. Un halfdifference espectro también se calcula simplemente para obtener una más precisa VCD espectro: ? A (S) corregida = 1/2 [A (S) en bruto -? A (R) en bruto] (7) Sin embargo, la corrección enantiómero se puede realizar sólo en el caso en que ambos enantiómeros están disponibles. Por lo tanto, la mayoría de los azúcares y proteínas son inaccesibles por este enfoque. Una forma alternativa y en general para corregir un espectro es solvente corrección donde se resta del espectro disolvente del espectro de la muestra en bruto: ? Acorrected = ASAMPLE -? Asolvent (8) A menos que la muestra es un líquido limpio, un espectro de IR también tiene que ser corregido por el espectro IR del disolvente. Para obtener un espectro VCD con una mayor precisión en el deseado región número de onda, un disolvente debe ser cuidadosamente seleccionada, así como la concentración, la muestra de células, e instrumental condiciones. CCl4 o CDCl3 han sido ampliamente utilizados para pequeñas moléculas quirales pero no son adecuados para la mayoría biomoléculas que son intrínsecamente hidrofílico. En su lugar, agua, óxido de deuterio o DMSO-d6 han sido frecuentemente elegido para analizar las biomoléculas. Estos disolventes pueden formar enlaces de hidrógeno con las moléculas de la muestra y luego afecta

las formas VCD, en parte, por la alteración de la conformación de la muestra. Contribución disolvente tal no siempre es indeseable y, en práctica, muchas moléculas biológicas se han medido el uso de disolventes tales [10]. Sin embargo, en caso de que la contribución disolvente necesariamente debe ser suprimida, el VCD se puede medir en el estado sólido. Así, algunos de estado sólido VCD espectros para los péptidos se han medido en aceite de halocarbono [11], y Espectros de VCD para los hidratos de carbono en KBr fueron recientemente reportado [12]. Cuando el óxido de deuterio o agua se selecciona como un disolvente, cual es poco común en un entorno normal de medición de infrarrojos, una ordinaria NaCl o células KBr muestra debe ser evitado. Esto es típicamente sustituye por una celda de muestra CaF2 o BaF2. Aunque un poco caro, éstos se utilizan en casi todas las mediciones de VCD. CaF2 ventanas impide la medición por debajo de 1000 cm-1. Sin embargo, BaF2 proporciona un espectro más amplio hasta ~ 750 cm-1 (Ver fig. 5), pero se debe tener cuidado con respecto a almacenamiento y manipulación debido a la delicuescencia ligera de BaF2. En De hecho, la solubilidad de NaCl, BaF2, y CaF2 en 100 g H2O a 08C son 35 g, 0,2 ~ g, y 0,002 ~ g, respectivamente. Absorbancia IR ajustado a alrededor de 0,4 es óptimo para VCD medida, que tendrá una muestra en la orden de mg. El requisito de la muestra de alta es desfavorable para la medición de biomoléculas raras. Otra desventaja de los VCD es, debido a la pequeña magnitud de las señales VCD, el necesidad de tiempo de recogida más largo, por lo general h 1 o más. La antes mencionada un-pineno es una excepción. Ofrece VCD espectros suficientemente altas relaciones S / N, incluso en sólo 5 min tiempo de exploración. El problema de la baja S / N está siendo mejorado a través de los nuevos desarrollos instrumentales [13]. 248 i 2004 Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim www.mnf-journal.de Figura 2. Diagrama de bloques del diseño óptico de un FTVCD espectrómetro. Cada componente de Chiralir y JV2001 se ha mencionado anteriormente. Mol. Nutr. Resolución de alimentos. 2004, 48, 246 a 254 CD emocional: el análisis de biomoléculas Chiroptical Determinación de la configuración absoluta Desde las primeras mediciones de VCD informó cristalina muestras en el año 1973 [14], y para líquidos limpios en el año 1974 [15], VCD se ha aplicado en muchos campos. Configuración absoluta determinación de compuestos sintéticos o naturales pueden ser la aplicación más común. Del mismo modo, VCD puede predecir un exceso enantiomérico en muestras farmacéuticas [16]. La Figura 3 muestra un ejemplo de la determinación del configuración absoluta de los productos naturales, donde dos crucíferas fitoalexina relacionados con metabolitos, dioxibrassinin (1) y 3-cianometil-3-hydroxyoxindole (2), se estudiaron [17]. 3-hidroxi-3-methyloxindole (3) se preparó como un modelo compuesto. Nótese que los espectros de VCD de un par de

enantiómeros son imágenes especulares entre sí. Generalmente, para determinar la configuración absoluta de un compuesto, una enantioméricamente pura de la muestra tiene que estar preparado y su espectro medido. Además, el espectro teórico de VCD tiene que ser calculado para una o más confórmero de energía más bajo ( s) derivados por análisis conformacional. Si dos o más confórmeros se consideran, el espectro final se crea por superposición de las poblaciones de Boltzmann ponderados. Conformacional análisis debe realizarse con sumo cuidado, y una estricta debe evitar pasar por alto o ignorar una confórmero con energía menor, ya que incluso las pequeñas conformacional diferencias puede cambiar drásticamente las características de VCD. Con respecto a este punto, VCD ha sido utilizada para analizar no sólo la configuración, sino también la conformación. A la inversa, el requisito para analizar varios confórmeros hace que sea difícil de calcular el espectro de un VCD conformacionalmente molécula flexible. En el caso de un flexible compuesto, el espectro superpuesto VCD de baja varias conformadores de la energía, la suma de pesos de Boltzmann de los cuales cubre más del 95% de las personas de todos los confórmeros brindará una mejor acuerdo entre un espectro calculado y observado uno. La estereoquímica de una molécula calculado es arbitrariamente seleccionado como (R) o (S) antes de cálculo. Finalmente, un calculado espectro VCD se compara con la observada uno. La correspondencia de la señal y el patrón de frecuencia entre un espectro observado y la teórica o su imagen de espejo indica que la estereoquímica del compuesto medido es el mismo que el uno o teórica es su opuesto, respectivamente. En el estudio de la figura. 3, todos los espectros fueron calculados en el B3LYP/6-31G (d, p) con nivel de Gaussian 98 arbitrariamente por los (S)-enantiómeros. Los espectros observado la presencia de 1, 2, y 3 tienen tres bandas características cerca de 1730, 1620 y 1470 cm-1, que también son exhibidas por los espectros calculados. Los signos de estas tres bandas mostró un razonable acuerdo entre la observada y calculada VCD con ligera diferencia de las frecuencias de sus número de onda. Estas comparaciones permitir a la conclusión de que las configuraciones absolutas de 1 y 2 son ambos S. Este resultado indicó que podría ser VCD útil en la determinación de la estereoquímica absoluta de terciaria alcoholes. El análisis estereoquímico es muy útil para la biosíntesis estudios sobre las vías y las investigaciones de actividad biológica. Así, VCD se puede aplicar a estos estudios. La eficacia de VCD se demuestra por su aplicación a las investigaciones de productos naturales como el gosipol, un terpenoide polifenólica aldehído se encuentra en las plantas de algodón [18], o sintética moléculas como la mirtazapina, un fármaco bien conocido ingrediente con efecto antidepresivo terapéutica [19].

Peptides and proteins VCD has also been used for the conformational analysis of peptides and proteins in an empirical manner. The secondary structure of a peptide or protein, such as a-helix, b249

i 2004 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim www.mnf-journal.de Figure 3. Comparison of observed IR and VCD spectra of two phytoalexinrelated metabolites (–)-1, (–)-2 and a model compound (–)-3 with their calculated spectra. T. Taniguchi et al. Mol. Nutr. Food Res. 2004, 48, 246 – 254

sheet, or random coil, is reflected in the VCD shape of the amide I (C=O stretch) and the amide II (N–H deformation and other vibration) regions (Fig. 4). AVCD spectrum of a right-handed a-helical structure was first reported for the polypeptide poly(benzyl-L-glutamate) in CHCl3 solution [20] exhibits a positive VCD couplet (a bisignate VCD couplet with a positive VCD and then a negative VCD with increasing wavenumber) in the amide I region and a small negative VCD in the amide II region. These VCD features of an a-helical structure can be observed in a protein containing a high fraction of a-helix such as hemoglobin [21]. A b-sheet structure exhibits distinctly different VCD features from an a-helix especially in the amide I region, where a b-sheet has a small negative VCD peak near 1600 cm–1. In the amide II region, a VCD spectrum of a b-sheet often exhibits a negative VCD couplet (the opposite of a positive VCD couplet) with relatively small intensity. Concanavalin A, which has a high b-sheet content with almost no helical structure, exhibits a VCD band shape as shown in Fig. 4 [21, 22]. However, some of the b-sheet forming oligopeptides could assume a different spectral character particularly in the amide II region. A random coil is an interesting case for VCD studies. In the

amide I region the VCD spectrum has a negative VCD couplet in which a stronger negative peak appears at lower wavenumber and a positive one appears at higher wavenumber. Also, a weak negative peak is observed in the amide II region. The feature in the amide I region is opposite to that seen in a right-handed a-helix. Accordingly, a “random coil” is assumed to contain a substantial amount of local left-handed structure [23]. Although there are some differences in the frequency, it is noteworthy that VCD features observed in a “random coil” are similar to the VCD spectra calculated for a left handed poly-L-proline type helix [22]. Additionally, calculated VCD spectra for a-helix, b-sheet, and 310 helix reveal good agreement with observed ones. One problem in measurement of a peptide or a protein in aqueous solution is the solubility of the sample. Because of the strong IR absorption of the solvent (H2O around 1650 cm–1), the pathlength must be reduced to ~6 lm. Therefore, the sample solution needs to be prepared at a high concentration. Also, in some cases, the solvent IR absorption itself may interfere with a highly accurate measurement in the amide I region. D2O provides an alternate possibility for measuring peptides or proteins at a lower concentration because a pathlength of 80 lm or more is acceptable. If D2O is used, a sample should be doubly lyophilized following dissolution in D2O before the VCD measurement to avoid expected noise caused by H–D exchange during the measurement. Deuteration confers slightly different spectral shapes than those observed for a non-deuterated sample. For example, a deuterated a-helical structure exhibits a three peaked negative-positive-negative pattern in the amide I9 (C=O stretch of a deuterated sample) region. In many cases, a VCD spectrum in the amide II9 region of a deuterated peptide or protein exhibits characteristically weak features [24]. Conventional ECD has been a well-established and widespread technique for the analysis of the secondary structure of peptides or proteins in solution. In contrast, VCD data contain additional information relative to ECD data since the VCD is dominated by local chirality while ECD reflects global chirality for the sample of interest. In light of this, VCD plays a complementary role to ECD in peptide and protein conformational analyses.

Carbohydrates Carbohydrates are important in synthetic research and industrial chemistry as “chiral pools”. Also, carbohydrates in the formof glycoproteins or glycolipids play a significant role in various biological phenomena investigated in the field of glycobiology [25]. However, in many cases, carbohydrate analysis is a laborious task due to the complex nature of carbohydrates. Therefore, several methods including NMR, MS and HPLC have been complementarily combined to study complex carbohydrate sequence, configura250

i 2004 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim www.mnf-journal.de Figure 4. Model VCD shapes of a-helix, b-sheet, and random coil structure in the amide I and II regions depicted from hitherto reported data. According to the peptide sequence, some sample will have an additional peak or show weaker features. A deuterated sample exhibits different VCD patterns. Mol. Nutr. Food Res. 2004, 48, 246 – 254 Vibrational CD: Chiroptical analysis of biomolecules

tion, conformation and composition. Yet, further development of analytical methods is still greatly desired. Irrespective of their chirality, most of carbohydrate analyses are

based on achiral theory, and chiral approaches have been of limited use. Optical rotation and optical rotatory dispersion provide indirect information about configuration and little

information about conformation. ECD would be more informative, but multistep chemical derivatization to add chromophores is required since the electronic transitions of most carbohydrates, excepting acid or amino derivatives, occur below 185 nm [26]. However, carbohydrates have well defined IR absorptions. Therefore, detailed stereochemical information can be extracted by VCD. Furthermore, VCD is very promising as an analytical tool because the parent IR spectra of various carbohydrates from monosaccharides to polysaccharides have already been measured to analyze their configuration and conformation.

Los péptidos y proteínas VCD también se ha utilizado para el análisis conformacional de péptidos y proteínas en una forma empírica. El secundario estructura de un péptido o proteína, tal como una hélice-, B249 i 2004 Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim www.mnf-journal.de Figura 3. Comparación de IR observado y VCD espectros de phytoalexinrelated dos metabolitos (-) -1, (-) -2 y un modelo compuesto (-) -3 Con la calculada espectros. T. Taniguchi y col. Mol. Nutr. Resolución de alimentos. 2004, 48, 246 a 254 bobina hoja, o al azar, se refleja en la forma de la VCD amida I (C = tramo O) y la amida II (N-H deformación y otras regiones de vibración) (Fig. 4). AVCD espectro de una mano derecha-una estructura helicoidal fue informó por primera vez para el polipéptido poli (bencil-L-glutamato) en CHCl3 solución [20] presenta un resultado positivo pareado VCD (un bisignate pareado VCD VCD con un resultado positivo y luego un negativos VCD con número de onda cada vez mayor) en la amida I región y una pequeña VCD negativo en la región II amida. Estas características VCD de una estructura de una hélice puede ser observado en una proteína que contiene una alta fracción de una hélice como la hemoglobina [21]. Una estructura de hoja b presenta características muy diferentes VCD a partir de una una hélice especialmente en la amida I región, donde a, b-hoja tiene un pequeño pico negativo VCD cerca de 1600 cm-1. En la amida II región, un espectro de VCD de una hoja b menudo presenta un efecto negativo pareado VCD (lo contrario de un resultado positivo Pareado VCD) con una intensidad relativamente pequeña. Concanavalina A, que tiene un alto contenido de B-hoja con casi ninguna helicoidal

estructura, exhibe una forma de banda VCD como se muestra en la fig. 4 [21, 22]. Sin embargo, algunos de los oligopéptidos hoja B-formadoras puede asumir un carácter espectral diferente, especialmente en la amida región II. Una bobina de azar es un caso interesante para los estudios de VCD. En el amida I región del espectro VCD tiene un negativo pareado VCD en el que un pico más negativo parece a un menor número de onda y una positiva aparece un mayor número de onda. Además, un pico negativo débil se observa en la amida II región. La característica de la región I amida es opuesta a la que visto en un diestro una hélice. En consecuencia, un azar " bobina "se supone que contiene una cantidad sustancial de locales la mano izquierda la estructura [23]. Aunque hay algunas diferencias en la frecuencia, hay que destacar que las características de VCD observado en una "espiral aleatoria" son similares a los espectros VCD calculado para una hélice izquierda mano tipo poli-L-prolina [22]. Adicionalmente, calculado espectros VCD para una hélice-, B-hoja, y 310 de hélice revelan una buena concordancia con los observados. Un problema en la medición de un péptido o una proteína en solución acuosa es la solubilidad de la muestra. Debido a la fuerte absorción IR del disolvente (H2O alrededor 1650 cm-1), el paso de luz debe ser reducida a ~ 6 LM. Por lo tanto, la solución de la muestra tiene que estar preparado en un alta concentración. También, en algunos casos, el disolvente de IR absorción en sí puede interferir con una medición muy precisa en la región I amida. D2O ofrece una alternativa posibilidad de que los péptidos o proteínas de medición a una menor concentración porque un paso de luz de 80 lm o más es aceptable. Si D2O se utiliza, una muestra debe ser doblemente liofilizado después de la disolución en D2O antes de que el VCD medición para evitar el ruido causado por esperada H-D intercambio durante la medición. Deuteración confiere formas espectrales ligeramente diferentes a los observados para un no deuterado muestra. Por ejemplo, un deuterado una helicoidal estructura exhibe un pico tres negativa-positiva-negativa patrón en la amida i9 (C = O tramo de una muestra deuterado) región. En muchos casos, un VCD espectro en la amida II9 región de un péptido o proteína deuterado exhibe característicamente características débiles [24]. ECD convencional ha sido bien establecida y generalizada técnica para el análisis de la estructura secundaria de péptidos o proteínas en solución. En contraste, VCD datos contener información adicional en relación con los datos de ECD, a partir el VCD está dominado por la quiralidad local, mientras que refleja ECD quiralidad global para la muestra de interés. En vista de esto, VCD desempeña una función complementaria a la primera infancia en el péptido y conformacionales de proteínas análisis. Los hidratos de carbono Los carbohidratos son importantes en la investigación y sintético química industrial, como las piscinas "quirales". Asimismo, los hidratos de carbono en las glicoproteínas o glicolípidos formade jugar un importante papel en varios fenómenos biológicos investigados en el

campo de la glicobiología [25]. Sin embargo, en muchos casos, los hidratos de carbono análisis es una tarea laboriosa debido a la naturaleza compleja de hidratos de carbono. Por lo tanto, varios métodos, incluyendo RMN, MS y HPLC se han combinado de manera complementaria para estudiar la secuencia de hidratos de carbono complejos, confi250 i 2004 Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim www.mnf-journal.de Figura 4. Modelo VCD formas de una hélice, hoja B-, y estructura de bobina al azar en la amida I y II regiones representado a partir de los datos reportados hasta ahora. De acuerdo con el secuencia peptídica, algunos muestra tendrá un adicional pico o muestran más débiles características. A muestra de ejemplo deuterados diferentes patrones de VCD. Mol. Nutr. Resolución de alimentos. 2004, 48, 246 a 254 CD emocional: el análisis de biomoléculas Chiroptical ción, la conformación y composición. Sin embargo, un mayor desarrollo de métodos de análisis sigue siendo en gran medida deseada. Independientemente de su quiralidad, la mayoría de los análisis de hidratos de carbono son basado en la teoría aquiral, y los enfoques han sido quirales de un uso limitado. La rotación óptica y la dispersión óptica rotatoria proporcionar información indirecta acerca de la configuración y poco información acerca de la conformación. ECD sería más química informativo, pero multipaso derivatización para añadir cromóforos es necesaria ya que las transiciones electrónicas de la mayoría de los hidratos de carbono, con la excepción de ácido o derivados de aminoácidos, ocurrir por debajo de 185 nm [26]. Sin embargo, los carbohidratos tienen bien definida absorción de rayos infrarrojos. Por lo tanto, estereoquímica detallada información se puede extraer por VCD. Además, VCD es muy prometedor como herramienta de análisis debido a que el padre espectros IR de los hidratos de carbono diferentes de monosacáridos a los polisacáridos ya se han medido a analizar su configuración y conformación. So far, only a few VCD applications for carbohydrates have been reported in contrast to the more widely studied peptides and proteins. Most of the published papers deal with monosaccharides solely in the mid-IR region [12, 27–30] or in the hydrogen stretching region [31, 32]. VCD spectra for some disaccharides in the mid-IR region appear in two publications including one review publication [33, 34]. The two publications also analyzed maltotriose and a-cyclodextrin. Observations of interactions between cyclodextrins and molecules or ions represent another area of interest [35, 36]. Nucleic acids and glycoproteins also contain a sugar moiety, but their VCD studies are not listed here. Except for such glycoconjugates, all these studies analyzed only simple sugars, and therefore available VCD peaks were concentrated at wavenumbers of 3800–2800 cm–1 and below 1550 cm–1 (Fig. 5). Actually, reported carbohydrate VCD spectra were restricted to 3100–2800 cm–1 for stretching vibrations of single C–H bond [31, 32], and restricted to 1550–900 cm–1 for stretching vibrations of single C–O and C–C bonds and for bending vibrations of various bonds [27–29, 33, 34]. In particular, numerous absorptions were observed below 1550 cm–1, but most of these showed weak and broad features. To amplify VCD intensity and to extend

the available spectral region, substitutions of hydroxyl groups could be effective. Polavarapu et al. [30] concluded that acetylated monosaccharides exhibited significant VCD peaks at ~1750 cm–1 (C=O stretches) and ~1370 cm–1 (bending of methyl groups). We also observed that benzoyl or other carbonyl-containing groups intensified the representative VCD signal about 10 times, but that other substituents such as benzyl groups did not result in a similar effect (unpublished data). Probably the introduction of carbonylcontaining groups constitute another possibility to analyze carbohydrates by VCD. Also, deuteration of hydroxyls by lyophilization from D2O can afford different useful VCD spectral features [28]. 251

i 2004 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim www.mnf-journal.de Figure 5. IR absorption of simple carbohydrates and the measurement conditions. Detector: InSb detector and MCT detector have to be adopted for the measurement of the hydrogen stretching region and the fingerprint region, respectively. Cell: representative two cell windows are shown. The solid lines indicate the available spectral region but the cell windows have a little absorption in the dotted zones. If a data in the dotted region is required, a solvent absorption has to be reduced as far as possible. Solvent: representative three solvents, which are sufficiently polar to dissolve a carbohydrate sample, are shown. They have Little

Hasta el momento, sólo unas pocas aplicaciones de VCD para los hidratos de carbono tienen han reportado en contraste con los péptidos más ampliamente estudiados y proteínas. La mayoría de los trabajos publicados frente a monosacáridos sólo en la región de infrarrojo medio [12, 27-30] o en la región de hidrógeno estiramiento [31, 32]. VCD espectros para algunos disacáridos en la región media del IR aparecen en dos publicaciones, incluyendo la publicación de revisión un [33, 34]. La dos publicaciones también analizó maltotriosa y una ciclodextrina. Las observaciones de las interacciones entre las ciclodextrinas y de moléculas o iones representan otra área de interés [35, 36]. Los ácidos nucleicos y glicoproteínas también contienen un azúcar fracción, pero sus estudios de VCD no se mencionan aquí. Excepto glicoconjugados tales, todos estos estudios se analiza solamente sencilla azúcares, y los picos de VCD por lo tanto, disponibles se concentraron en números de onda de 3800-2800 cm-1 y por debajo 1550 cm-1 (Fig. 5). En realidad, informó carbohidratos VCD los espectros se restringe a 3100-2800 cm-1 para el estiramiento vibraciones de un solo enlace CH [31, 32], y se limita a 1550-900 cm-1 para las vibraciones de un solo C-O y C-C bonos y las vibraciones de flexión de varios bonos [27-29, 33, 34]. En particular, absorciones numerosos fueron observado por debajo de 1550 cm-1, pero la mayoría de ellos mostró débil y características generales. Para amplificar la intensidad de VCD y se extienden a la región espectral disponible, las sustituciones de hidroxilo grupos podría ser eficaz. Polavarapu et al. [30] llegó a la conclusión monosacáridos acetilados que presentó más VCD picos a ~ 1750 cm-1 (C = O) se extiende y ~ 1370 cm-1 (flexión de grupos metilo). También se observó que de benzoilo o otras que contienen grupos carbonilo intensificado el representante VCD señal unas 10 veces, pero que otros sustituyentes tales como grupos bencilo no dio lugar a un efecto similar

(Datos no publicados). Probablemente, la introducción de carbonylcontaining grupos constituyen otra posibilidad de analizar hidratos de carbono por parte de VCD. Además, deuteración de hidroxilos por liofilización de D2O puede permitirse diferentes útiles VCD características espectrales [28]. 251 i 2004 Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim www.mnf-journal.de Figura 5. IR absorción de hidratos de carbono simples y las condiciones de medición. Detector: detector de InSb y el detector MCT tienen que ser adoptadas para la medición de la región de hidrógeno de estiramiento y la región de huellas dactilares, respectivamente. Celular: representante dos ventanas de las celdas se muestran. Las líneas continuas indican la región espectral disponible, pero los ventanas de las celdas tienen un poco absorción en las zonas punteadas. Si un conjunto de datos en la región de puntos se requiere, una absorción de disolvente tiene que ser reducido en la medida de lo posible. Disolvente: representativas tres disolventes, que son suficientemente polar para disolver una muestra de hidratos de carbono, se muestran. Ellos tienen poco

Prasad L. Polavarapu · Chunxia Zhao

Vibrational circular dichroism: a new spectroscopic tool for biomolecular structural determination Fresenius J Anal Chem (2000) 366 :727–734 © Springer-Verlag 2000 Received: 31 August 1999 / Revised: 2 November 1999 / Accepted: 14 November 1999

Abstract Vibrational circular dichroism (VCD) in the past two decades has developed into a powerful new structural tool. A concise review of the applications of VCD to determine the structures of various biological molecules, namely peptides and proteins, nucleic acids and carbohydrates, is provided.

Resumen dicroísmo circular vibracional (VCD) en el últimas dos décadas se ha convertido en una nueva y poderosa estructura herramienta. Una revisión breve de las aplicaciones de VCD a determinar las estructuras de varias moléculas biológicas, a saber, péptidos y proteínas, ácidos nucleicos y carbohidratos, se proporciona.

1 Introducción Las estructuras de biomoléculas en la fase de solución se determinan, en la mayoría de los casos, de resonancia magnética nuclear (RMN) o estudios de dicroísmo circular electrónicos (ECD). En una mayoría de los estudios de ECD, las características dicroísmo circular asociado con uno o dos transiciones electrónicas que aparecen en el rango visible se utilizan para deducir las estructuras. Muy a menudo, en particular cuando la molécula de bajo consideración no tiene cromóforos que absorben en el visible región, las transiciones electrónicas de la molécula de bajo cuenta aparecerá en la región del ultravioleta lejano. Este Es cierto en la mayoría de péptidos y proteínas. Es muy común que los

estos sistemas para contener grupos aromáticos y en tales casos las transiciones electrónicas de los residuos aromáticos se superponen con los de los grupos de péptidos. Cuando esto sucede la estructura general del péptido / proteína no es claramente revelado por las características de DIT observados. Aun cuando hay están sin interferir residuos aromáticos, el número de acceso transiciones electrónicas se limita por lo general, limitando así deducible de la información estructural de la primera infancia. A pesar de estos inconvenientes, la ECD en el siglo pasado tiene resultado [1] a ser un extremadamente útil, y se practica ampliamente técnica para la determinación de la estructura biomolecular. Un método alternativo que mantiene o mejora en, la sensibilidad estructural que tiene ECD, pero elimina la limitaciones antes mencionadas se saludaron con entusiasmo por la comunidad de la biología estructural. Vibracional dicroísmo circular (VCD), donde dicroísmo circular es seguimiento en las transiciones vibracionales, es una de esas alternativas método [2]. La ventaja de VCD proviene (A) la presencia de numerosos transiciones vibracionales (como oposición a limitados transiciones electrónicas), (b) el natural separación de la vibración que se extiende desde el carbonilo aromático vibraciones del grupo (a diferencia de la superposición de electrónica transiciones de grupos de péptidos con los de aromático residuos). Sin embargo, estas ventajas a expensas de (a) menor magnitud de las señales de VCD, que requieren ya la recopilación de datos, (b) el aumento de concentraciones de la muestra necesario para medir el VCD y (c) el uso restringido de agua como disolvente. Estas desventajas, sin embargo, están abrumados por la cantidad de información disponible estructurales partir de los espectros de VCD. En el presente manuscrito, se hace un intento para proporcionar un resumen de la utilidad de VCD para biomolecular estructura de determinación. El énfasis está en dar una descripción concisa resumen, en lugar de una una amplia, de modo que una recién llegado a esta zona se puede encontrar referencias apropiadas y cómodas.

2 Los métodos experimentales Instrumentación. Actualmente hay dos tipos de instrumentos en uso para los estudios de VCD. (A) dispersivo VCD instrumentos [2, 3], (b) la transformada de Fourier de infrarrojos (FTIR)-VCD instrumentos [4]. Instrumentos dispersivos se utilizan generalmente para medir VCD en el hidrógeno / deuterio estiramiento región (3500-2000 cm-1). En esta región, FTIR-VCD instrumentos Se han utilizado solamente para la demostración de la viabilidad, pero no para las mediciones de rutina de VCD. En el Por otro lado, para las mediciones de VCD en los ~ 2000-600 cm-1 región, los instrumentos de dispersión y FTIR-VCD tienen han utilizado, aunque en los últimos años FTIR-VCD instrumentos son más comúnmente utilizados. Todos los instrumentos dispersivo VCD utilizado hasta la fecha se han construido en la casa y

no se han comercializado a partir de ahora. El lector puede encontrar la información pertinente sobre estos instrumentos en [2] y [3]. Hasta hace poco, los instrumentos FTIR-VCD fueron Prasad L. Polavarapu · Chunxia Zhao Dicroísmo circular vibracional: una herramienta espectroscópica nueva para la determinación estructural biomolecular Fresenius J Anal Chem (2000) 366 :727-734 © Springer-Verlag 2000 Recibido: 31 de agosto de 1999 / Revisado: 2 de noviembre de 1999 / Aceptado: 14 de noviembre 1999 EXAMEN P. L. Polavarapu (Y) · Cap. Zhao Departamento de Química de la Universidad de Vanderbilt, Nashville, TN 37235, EE.UU. también construido en la casa, pero que ya están disponibles comercialmente. Los detalles de FTIR-VCD instrumentación puede ser encontrarse en [4], mientras que los de un comercial de FTIR-VCD instrumento puede obtenerse a partir de [5]. Todos los espectros se muestran en este manuscrito se midieron en nuestro laboratorio usando un instrumento comercial VCD CHIRALIR [5]. Preparación de la muestra. Mediciones de VCD son comúnmente cabo sobre muestras en el líquido (como puro o en solución) o fases de gas. A pocas mediciones se han hecho para muestras en la fase sólida (como mulls), pero los artefactos posibles aquí se limitan tales mediciones. Los disolventes orgánicos inertes tales como CCl4 y CS2 son buenos disolventes para los estudios de VCD en la región del infrarrojo medio, como la absorción de infrarrojos interferir a partir de estos disolventes se limita a la frecuencia pequeña rangos. El agua tiene una fuerte absorción en el infrarrojo a ~ 1650 cm-1, como consecuencia de la cual el agua puede ser utilizado como disolvente sólo cuando la longitud de trayecto corto (~ 6 mm) y mayor concentración de la muestra puede ser empleado. Diferentes rangos de frecuencia son accesibles en disolventes tales como D2O, DMSO-d6, CHCl3, CDCl3, trifluoroetanol, metanol y propanol-D4. A menos que caminos ópticos muy pequeños se pueden utilizar, los rangos de frecuencia que no son accesibles en la región 2000-700 cm-1 con estos disolventes son: por debajo de 970 cm-1 en CCl4, del ~ 1640-1350 cm-1 en CS2, del ~ 1260-1175 cm-1 en CHCl3, por debajo de 975 cm-1 en CDCl3, del ~ 1100-970 cm-1 en DMSO-d6, por debajo de 1300 cm-1 en D2O, por debajo de 1200 cm-1 en metanol-D4 y por debajo de 1500 cm-1 en propanol y trifluoroetanol. Las concentraciones de la muestra necesario para estudios VCD dependerá de la mencionada interferencia absorción de disolvente y de la absorción intensidades de la muestra. Generalmente es necesario para mantener la absorbancia (de disolvente + soluto) por debajo de ~ 1,0. Para el control de el VCD en la región de carbonilo, la concentración empleadas en la mayoría de los péptidos es del orden de 4 mg / ml o superior. 3 Terminología Algunos de los términos utilizados en la literatura que es relevante para la presente discusión se resume a continuación. (a) Bisignate VCD copla: Un par de bandas de VCD, con

signos opuestos, que aparecen uno junto al otro, los asociados con una banda de absorción, (b) Positivo pareado VCD: Un bisignate pareado VCD VCD con positivo en la parte inferior frecuencia lado negativo y VCD en la frecuencia más alta lado de una banda de absorción, (c) Negativo pareado VCD: Un bisignate pareado VCD con negativos VCD en la parte inferior frecuencia lado positivo y VCD en la frecuencia más alta lado de una banda de absorción, (d) sesgo positivo: la intensidad VCD de componente positivo es mayor que la de negativo componente en un pareado VCD, (e) el sesgo negativo: el Intensidad VCD de componente negativo es mayor que el de componente positivo en un pareado VCD; (f) amida Una región (3400-3200 cm-1): La región donde se extiende el NH vibración del grupo amida aparece; (g) amida I región (1800-1600 cm-1): La región en la que C = O se extiende vibración del grupo amida aparece; (h) amida II región (1600-1500 cm-1): La región donde la mayor parte Vibración NH flexión acoplado a la vibración NC estiramiento del grupo amida aparece: (i) amida III región (1300-1100 cm-1): La región donde la mayor parte Vibración NC estiramiento acoplado a la vibración de flexión NH del grupo amida aparece, (j) amida región A ¢: La región donde el ND estiramiento vibración del grupo amida deuterado aparece; (k) amida región de ¢ I (1800 1600 cm-1): La región donde el C = O estiramiento vibración del grupo amida, con N-H deuterado, aparece. (l). Amida II región de ¢ (1500-1400 cm-1): La región en la que predominantemente ND vibraciones de flexión, junto a la CN vibración de tensión del grupo amida aparece

4 estructura de Spectra-correlaciones A péptidos y proteínas Correlación de los VCD con el péptido / proteína de estructura secundaria: Las estructuras secundarias más comunes de las proteínas son una hélice, la bobina B-hoja y al azar. Además, 310-hélices, b-vueltas, b-horquillas y p hélices también se encuentran en las estructuras de proteínas. En esta sección, un resumen de las correlaciones encontrado, a través de observaciones experimentales, entre VCD y conocidas estructuras secundarias se da. una hélice. En solución de cloroformo, poli (g-bencil-L-glutamato) Se considera que adoptar un diestro una helicoidal estructura. El espectro de VCD de poli (g-bencil-L-glutamato) en la amida Una región tiene un efecto negativo pareado VCD [6] con sesgo positivo, asociado con la banda de absorción a ~ 3290 cm-1. Un resultado positivo de copla VCD está presente en la amida I región. En la amida región II, la absorción de banda a ~ 1550 cm-1 se asocia con el pequeño inconveniente de VCD. Pero en 1520 cm-1, donde la banda de absorción tiene una leve intensidad, una señal negativa grande VCD está presente. El VCD características mencionadas en las tres regiones se consideran ser característica de un diestro estructuras helicoidales,

como se evidencia por las características similares para otros péptidos que se sabe que tienen un diestro estructuras helicoidales. Estudios posteriores en una variedad de polipéptidos indicado estos patrones para presentar las características de la mano derecha a-hélice. Cuando el protón amida se deuterados, VCD cambios desde un pareado negativa-positiva en la amida I región a un negativo positivo-negativo triplete. El espectro de VCD de la hemoglobina, que se sabe que la mano derecha una helicoidal estructura, se muestra en la fig. 1. El poli (b-bencil-L-aspartato), que se sabe que tiene un zurdo una estructura helicoidal en solución de cloroformo, da [6] signos opuestos para VCD. Aunque las características de VCD visto en la amida región II no son bastante para reflejar imágenes polipéptidos con derecha e izquierda, los zurdos estructuras helicoidales una clara diferencia está presente entre ellos. b-hoja. Poli (L-lisina) cuando se calienta en condiciones de pH alto adopta antiparalela b-hoja de estructura. El espectro de VCD de poli (L-lisina) en D2O a pH 11,5, se calienta a 65 ° C, muestra dos bandas separadas negativas en la región I de amida [7]. Estos son considerados como rasgos característicos de 728 la antiparalela b-hoja de estructura. Para situaciones donde un una mezcla de estructuras de hélice y b-hoja están presentes, el observó VCD en la amida I región muestra una mezcla de a-hélice y b-VCD hoja de espectros, con una forma de W. La VCD espectro de citocromo-c, que se sabe que tiene una mezcla de estructuras a-hélice y b-hoja, se muestra en Fig. 2. Hélices al azar. Poli (tirosina) se conoce a someterse disolvente inducida transiciones estructurales. En dimetilsulfóxido (DMSO) disolvente, la estructura de poli (L-tirosina) se considera a ser una bobina al azar, mientras que en disolvente mixto sistemas (véase más adelante) es un diestro de una hélice. Un, bien ordenado pero que no se repite la conformación generalmente se clasifica como la estructura de la bobina. Algunas veces esto también se refiere como espiral aleatoria (aunque esto no significa realmente aleatoria o estructura desordenada). Poli (L-tirosina) en sulfóxido de dimetilo muestra solventes [6] un resultado positivo pareado VCD en la amida Una región y una negativa pareado VCD en la región I de amida. Débiles señales VCD se ven en la amida región II con un banda positiva a 1520 cm-1. Estos patrones de signos son opuestos a las observadas para la mano derecha una hélice las estructuras, pero son similares a los observados para zurdos una hélice estructuras. Cuando el disolvente se cambia de dimetilsulfóxido puro a una mezcla 80:20 (en volumen) de dimetilsulfóxido con ácido dicloroacético, (o con ácido trifluoroacético) el VCD firman los patrones en la amida regiones A y se invierten. En Además, la amida región II en este sistema disolvente mixto muestra dos bandas negativas VCD, uno en 1545 cm-1 y otro en 1520 cm-1. El espectro de VCD de poli (L-tirosina) en una mezcla 50:50 de sulfóxido de dimetilo y trimetil fosfato es similar a la observada en el sulfoxidedichloroacetic dimetil

ácido mezcla. Estos estudios son VCD en concurrencia con las conclusiones de la literatura que la poli (L-tirosina) adopta un diestro una estructura helicoidal en el disolvente mixto Los sistemas mencionados anteriormente. En dimetil sulfóxido disolvente, la estructura de poli (L-tirosina) se sugirió a ser una bobina al azar, pero la similitud de VCD espectros obtenidos aquí a los obtenidos para un zurdo estructuras helicoidales sugirió que la estructura de bobina al azar aquí tiene algunos zurdo ordenamiento local. Poli (L-lisina) se sabe que existe en la estructura de bobina al azar a pH neutro. El espectro de VCD de poli (L-lisina) a un pH neutro en D2O muestra [7] un pareado negativa con sesgo negativo en la región de amida de ¢ I (Ver fig. 3). Así, un pareado negativa (con una polarización negativa) en el región amida I (o amida I ¢) es un rasgo característico de estructura de la bobina al azar con una izquierda ordenamiento local manos en la masa. Una estructura de bobina al azar sin ningún tipo de ordenamiento local podría ser denominado "desordenada espiral aleatoria" estructura. En tales casos, VCD en la región I amida desaparece. Por ejemplo, poli (L-lisina) en condiciones de alta salinidad (en 5 M Solución de NaCl) pierde toda la intensidad de VCD en la amida I región [7]; gramicidina D en DMSO-d6 o solución trifluoroetanol, donde se sabe que en la estructura de bobina al azar, no muestra VCD (ver fig. 4). 729 Fig. 1 La absorción (parte inferior) y VCD (arriba) del espectro de la hemoglobina en H2O (concentración: 254 mg / ml; paso de luz: ~ 7 mm) en La amida I y II regiones Fig. 2 La absorción (parte inferior) y VCD (arriba) del espectro del citocromo C en H2O (concentración: 252 mg / ml; paso de luz: 6 mm) en la amida I y II regiones 310-hélice. Las proteínas que adoptan 310-hélice estructura son menos común, pero la presencia de un dialquilado-amino isobutírico ácido (AIB) de residuos en polipéptidos aparentemente bloqueados favorece la formación de esta estructura. Tales péptidos Se estudiaron [8] para establecer la característica VCD características asociadas con las estructuras de 310-hélice. La amida Una pareado está positivamente sesgada para las estructuras de una hélice, pero es casi equilibradas para 310-hélice estructuras. En la amida II región, sin embargo, 310-hélice estructuras dan negativo VCD que se asocia con la intensidad de absorción sustancial en Del ~ 1520 cm-1. Esto es diferente de la observada en las estructuras de una hélice, donde la intensidad pico de absorción es a ~ 1550 cm-1, y los picos negativos VCD intensidad a ~ 1520 cm-1. El diestro 310-hélice de la estructura se pueden distinguir de la mano derecha una hélice estructura basada en la relación intensidades de las bandas de amida I y II, en lugar de en el patrón de señal. Amida I VCD está positivamente sesgada y es mucho más débil de amida II VCD para una estructura 310-hélice, mientras amida I VCD es negativamente sesgada y es mucho más fuerte que amida II VCD para un diestro de una hélice. b-doble espiral de la cinta. Oligopéptidos terminales bloqueados (Lproline-

Aib) N y Aib-(L-prolina-Aib) n, donde se encuentra Aib para un residuo de ácido-aminoisobutírico, se sugirió que tienen b-doblar las estructuras de la cinta en espiral que se consideran un tipo de estructura sub-310-hélice. Los espectros obtenidos VCD para tales péptidos en solución de cloroformo se indica [9] que la región I de amida tiene una copla positiva, con un sesgo positivo, centrado en ~ 1641 cm-1. El algo más alto amida I frecuencia aquí (en comparación a la de la prolina oligómeros) se atribuye a la presencia tanto de secundaria y grupos amida terciaria. La amida región II muestra una fuerte negativa VCD en 1535 cm-1, que es también la posición de máxima absorción fuerte. Estos son también el rasgos característicos asociados anteriormente con 310-helicoidal estructuras. Entonces uno puede apoyar la idea de que la curva de la cinta-b estructuras espirales se relacionan con 310 estructuras helicoidales. Sin embargo, esta observación también puede ser visto como un reflejo la insuficiencia de la amida I en la diferenciación de las características de VCD entre estos dos tipos de estructuras. La cadena dependencia de la longitud de las intensidades normalizadas VCD indica que el carácter de la cinta b-curva emerge tan pronto cuando n = 2 o 3 y se desarrolla por completo en n = 5 a 6. b-vuelta. Así como una estructura de bobina representa una que no se repite conformación de un "giro" también representa una conformación que no se repite con al menos cuatro residuos de aminoácidos que participan en un turno. En un giro común (denominado de tipo I vuelta), los cuatro átomos de carbono a los que un ángulo diedro de 45 ° ~. A su vez glicina (referido como tipo A su vez II), el cuatro a-carbonos y el enlace de hidrógeno (entre el O = C de residuo 1 y NH del residuo 4) mantenerse aproximadamente en un avión. Un gsu vez, en contraste se estabiliza por 1-3 H-unión. El cristal estructura de un pentapéptido cíclico, ciclo-(-Gly-Pro-GlyD-Ala-Pro) revela un giro de tipo II y una vez g. El VCD espectro en la región que mostró amida [10] una negativa 730 Fig. 3 La absorción (parte inferior) y VCD (arriba) el espectro de poli (L-lisina) en D2O (concentración: 50 mg / ml) en la amida I ¢ y en las regiones II ¢ Fig. 4 La absorción (parte inferior) y VCD (arriba) del espectro de la gramicidina D en DMSO-d6 (concentración: 4 mg / ml; paso de luz: 350 mm) en la amida I y II regiones positiva-negativa patrón. Estos picos están bien separadas en comparación con las observadas en VCD espectros asociado con unhélice, b hojas y las estructuras de la bobina. El espectro de VCD de ciclo-(Cys-Pro-Gly-Cys-) en sulfóxido de dimetilo disolvente muestra un patrón similar, con mucho menos negativa de intensidad VCD para el enlace de baja frecuencia. El espectro de VCD este péptido cíclico y el de ciclo-(Gly-Pro) 3 se encontraron para mostrar cambios significativos en función del disolvente. Lo Se sugirió que la movilidad conformacional de este péptido cíclico puede ser convenientemente probaron utilizando VCD. La amida Un VCD de oligopéptidos que contienen bloqueados prolina, en disolventes orgánicos, se encontraron [11] para exhibir

rasgos característicos de conformaciones que representan el g-y b-turnos. b-horquilla. Una variedad de péptidos que se sabe que adoptar horquilla b-estructuras han sido estudiados. En todos estos casos, la amida I VCD se encuentra que es claramente diferente y es característico de estructuras de horquilla [12]. p-(doble) hélices. Gramicidina D diferentes tipos de forma doble hélice o de las estructuras p-helicoidales en diferentes ambientes. En presencia de iones Cs + en metanol-D4, que adopta un diestro doble hélice antiparalela. El VCD espectro de gramicidina D en la presencia de iones Cs + muestra dos coplas yuxtapuestos negativos [13] en la amida I región, y un pareado positivo en la amida región II. Este patrón, diferente de los observados para cualquier otra estructura, caracteriza de la mano derecha de doble hélice antiparalela (ver Fig. 5). En presencia de iones Ca2 +, la estructura de gramicidina D cambios en zurdos doble hélice paralela. Este reversión de uso de las manos muestra claramente en el espectro de VCD de gramicidina D en la presencia de iones Ca2 + (ver fig. 6), como dos coplas positivos yuxtapuestos se ven en la amida I región, y una copla negativo en la amida II región [13]. B ácidos nucleicos Dos regiones espectrales diferentes fueron usados para investigar las estructuras de ácidos nucleicos utilizando espectroscopía VCD [14-16]. Una región es 1700-1600 cm-1 donde C = O, C = N y C = C modos de estiramiento de las bases de ácidos nucleicos se espera a aparecer. Las bandas de absorción que aparecen por encima de Del ~ 1650 cm-1 están asociados con el C = O y apareciendo los por debajo, aproximadamente 1650 cm-1 se asocian con C = C los modos de tensión (con una cierta contribución de C = N estirando así). La adenosina no tiene grupos C = O, pero citosina, inosina, guanosina y tienen un grupo C = O cada y uridina tiene dos grupos C = O. Esta diferencia en el composición química básica se puede esperar que influyen la naturaleza de VCD de ácidos nucleicos con base diferente composiciones. El espectro de VCD de ácido poliadenílico [Poli (A)], en la región 1800-1400 cm-1, se muestra en la fig. 7. 731 Fig. 5 La absorción (parte inferior) y VCD (arriba) del espectro de la gramicidina D en metanol-d4 (concentración: 4 mg / ml; paso de luz: 325 mm) en la presencia de iones Cs + (concentración: 40 mM) en el ¢ amida I y II regiones ¢ Fig. 6 La absorción (parte inferior) y VCD (arriba) del espectro de la gramicidina D en metanol-d4 (concentración: 4 mg / ml; paso de luz: 325 mm) en la presencia de iones Ca +2 (concentración: 4,8 mM) en el ¢ amida I y II regiones ¢ La segunda región es 1250-1000 cm-1, donde la simétrica antisimétricas y los modos de tensión de la PO2 - Grupo de y algunos modos de vibración de la fracción de azúcar se espera a aparecer. Si estos modos no están acoplados a los procedente de las bases, a continuación, el VCD que aparece en

esta región se puede esperar que sea independiente de la base composición. Homopolímeros de ARN. En el 1700-1600 cm-1 región, monoribonucleotides se encontró que tenían [14] muy poco VCD. Pero dímeros se encontraron para dar un positivo débil VCD copla. El mismo patrón VCD signo también está presente para los homopolímeros de ácidos ribonucleicos, pero con las magnitudes de las intensidades de VCD mejorado significativamente. Estos observaciones llevan a la sugerencia de que la positiva observada Pareado VCD es principalmente debido al acoplamiento base-base. Entre los homopolímeros de ácidos ribonucleicos, poli (rI) se encontró para dar dos a tres veces más grande VCD magnitudes que poli (rA) y poli (RC), y una orden de magnitud mayor que las magnitudes VCD poli (rG) y poli (RU). Si bien estas grandes diferencias en las magnitudes de VCD debe reflejar la intensidad de algunas diferencias en la conformación detalles, la invariabilidad del patrón de señal de VCD entre estos ácidos ribonucleicos poli proporcionado un común factor para la investigación estructural. Copolímeros de ARN. Los copolímeros de ácidos ribonucleicos También se encontraron [14], para dar un resultado positivo en la copla VCD 1700-1600 cm-1 de la región. En el caso de poli (rC, RU), el normalizadas magnitudes VCD resultaron ser, aproximadamente, la media de las que se encuentran para el poli (RC) y poli (RU). Tal característica aditivo no es aplicable en general, porque en el caso de poli (A, U) y poli (A, C), el observados magnitudes VCD no corresponden a los promedios de las magnitudes encontrados para el individuo polyribonucleic ácidos. El espectro de VCD de poli (I, C) se encontró que ser bastante similar a la de poli (I), con una diferencia de ser que las posiciones de la banda de absorción y VCD de poli (I, C) hacia arriba desplazado en la posición de frecuencia. Dobles y triples polímeros hebra. Los espectros de VCD los polímeros de doble filamento de poli (I) poli (C) y poli (A) · poli (U) se encontró que eran similares a las de la correspondiente copolímeros poli (I, C) y poli (A, U), respectivamente. Las aplicaciones más útiles de las similitudes (Y diferencias) que se observa entre las características de los diferentes VCD Los ácidos nucleicos se pueden encontrar en la deducción de la estructural transiciones de un ácido nucleico dado bajo experimental diferente condiciones. Una de tales aplicaciones se demostró [15] mediante la supervisión del VCD de poli (rA) poli (r) como una función de la temperatura. En el 1700-1600 cm-1 región, el espectro de VCD de poli (rA) poli (r) en el 25 ° C rango de contenido (-, -, +, -, +) patrón de señal. Este cambios en el patrón de (-, +, +, -, +, -, +) cuando la temperatura se mantiene en el 54-60 ° C rango. La frecuencia la separación entre las tres primeras bandas de frecuencias más altas, considera que se originan en el C = O se extiende modos de los residuos de U, aumenta a medida que se aumenta la temperatura. Sin embargo, como la temperatura se incrementa aún más por encima de 65 ° C, VCD asociado con estas bandas se desvanece.

Las bandas que aparecen en el 1650-1660 cm-1 región (Que se considera que se originan en el C = C modos de estiramiento de los residuos a) Sin embargo no se ven afectados por este aumento de temperatura. Un gráfico de la intensidad de VCD cambios en la región (1700-1650 cm-1) como un función de la temperatura reveló que se producen cambios bruscos en el 52-54 ° C y 60-65 ° C varía. Temperatura similar dependientes de los estudios de VCD en triples cadena poli (A) poli (r) poli (r) no reveló cambios abruptos para las bandas de 1700-1650 cm-1 en lugar de la región; VCD cambios de intensidad como una función de la temperatura fueron encontrado para seguir una línea suave. Único poli cadena (rA) y poli (r) también, que no presentan cambios abruptos en VCD intensidades como la temperatura se aumenta a 70 ° C. Por comparando las intensidades VCD observados en diferentes temperaturas de poli (rA), poli (r), poli (rA) poli (r) y poli (rA) poli (r) poli (r), se concluyó que los dos bruscos cambios de intensidad VCD mencionados anteriormente para el poli (rA) poli (r) corresponden a la transición estructural de doble cadena a la cadena de triples (52-54 en ° C) y solo filamento (a 60-65 ° C) formas. El ordinario posiciones de absorción de infrarrojos de la banda (o intensidades) de ellos fueron incapaces de identificar el segundo estructural transición (a 60-65 ° C), por lo que la importante función de las intensidades de VCD es subrayada por estas investigaciones. 732 Fig. 7 La absorción (parte inferior) y VCD (arriba) el espectro de poli (A) (concentración: 40 mg / ml, paso de luz: 50 mm) en D2O cacodilato de sodio que contiene (0,05 M) y NaCl (0,1 M) en el amida ¢ I y II amida regiones ¢ A-, B y Z-ADN forma. El B ® Z y B ® A estructurales transiciones en los ácidos desoxirribonucleicos puede ser inducida [16] utilizando altas concentraciones de sal y las concentraciones de alcohol respectivamente. El B-y se forma de la mano derecha han helicoidal estructuras, pero la forma Z tiene a la izquierda helicoidal de mano estructura. El B-forma se caracteriza por la aparición de un positivo pareado VCD en el 1700-1650 cm-1 región y otro pareado del patrón mismo signo en 1087 cm-1. El pareado esta última se asocia con simétrica PO2 estiramiento modos. Los signos de coplas VCD en estos dos regiones se encontró que se invierte para el Z-forma. Aunque las posiciones de la banda de la O = C modos de estiramiento la forma Z se encontraron para pasar a frecuencias más bajas en comparación a los de la forma B, las posiciones de banda del simétrica PO2 - Modos de estiramiento son esencialmente los mismos para ambas formas. Así, los pareados VCD asociado con simétrica PO2 - Los modos de tensión de los B-y Z-formas aparecen más como imágenes especulares entre sí y proporcionan una acción clara para su identificación.

Los espectros de VCD de la B-A y formularios se encontró que ser cualitativamente similar. Sin embargo, hay diferencias entre ellas en la región C = O estiramiento y estas diferencias dependen fuertemente de la secuencia o distribución de las bases. Los estudios espectrales VCD se llevaron a cabo también en la interacción desoxirribo de los oligonucleótidos con iones metálicos y con daunorrubicina [16e-g]. Los hidratos de carbono C Los monosacáridos. Estudios de VCD en hidratos de carbono son cuatro papeles en la región del infrarrojo medio [17] y dos documentos en la región de hidrógeno estiramiento [18]. VCD bandas características anómeros de puede ser utilizado para caracterizar el anómeros. Los azúcares homomórficas se encuentran para dar lugar a patrones similares de signo VCD siempre que los sustituyentes no han interferir bandas VCD o interferir en los bandas pueden ser identificados. Los azúcares epímeros tienen marcado diferente espectros VCD lo que indica que es sensible a VCD la quiralidad en los distintos centros quirales. Glicosídico. Espectros de dicroísmo circular vibracional de soluciones acuosas de disacáridos seleccionados, maltosa, isomaltosa, una, una trehalosa-celobiosa, y gentiobiosa eran medido en la región 2000-900 cm-1 [19]. Estos espectros, junto con los de D-glucosa, es un (1 ® 4) vinculado maltotriosa trisacárido, y un (1 4 ®) vinculado oligosacárido cíclico, una ciclodextrina, en solución acuosa, fueron utiliza para identificar los rasgos característicos asociados con glicosídico. Se encontró que una oligosacáridos unidos de la glucosa tienen señales medibles VCD con características VCD patrones de los signos en el 1200-900 cm-1 de la región. Por otro lado, los oligosacáridos b-enlazados de la glucosa no mostraron importantes características de VCD en esta región. Para ilustrar este punto, los espectros de VCD de 6-OaD-galactopiranosil D-glucosa y 4-galactopiranosil-DAB D-glucosa se muestra en la figura. 8. Estos resultados sugieren que VCD puede ser utilizado como una sonda para identificar el potente tipo de enlace glicosídico presentes en los oligosacáridos.

5 enfoques teóricos precisos para estructurar la determinación La predicción precisa de dicroísmo circular vibracional espectros requiere estimaciones fiables de las tres cantidades diferentes: vectores normales de coordenadas (que dependen de la fuerza constantes y la geometría molecular), atómicas tensores polares y atómicas tensores axiales. Varios acontecimientos importantes se han producido en los últimos años en el cálculo de la tarde utilizando los métodos de la mecánica cuántica. La cuantía métodos teóricos desarrollados para VCD tienen en general tenido éxito en la reproducción de los espectros experimentales de una variedad de sistemas moleculares, cuando se implementa ab

initio utilizando moderada a los conjuntos de base de gran tamaño. Estos cálculos Se han hecho uso de Hartree-Fock (HF), después de HF y funcional de la densidad teorías (DFT). Los tensores axiales atómicas Se han evaluado en el nivel de HF, empleando el conjuntos de estándares básicos, con la versión traducida de los orbitales moleculares (OVM) [20], la perturbación del campo magnético (MFP) [21-24], vibrónica acoplamiento (VC) [25] y nuclear eléctrica blindaje tensor [26] métodos. Se evaluaron también con una aleatoria fase de aproximación (RPA) [27], y con la inclusión de correlación de electrones utilizando el método de VC [28]. Uso de los invariantes de calibre orbitales atómicos (GIAOs), la MFP método también se ha utilizado para calcular el atómica tensores axiales en el SCF [29], después de la FEC [30] y la DFT [31] los niveles. El método de impresora multifunción utilizando GIAOs y DFT, que 733 Fig. 8 La absorción (inferior) y VCD (arriba) el espectro de una ligada (a) yb vinculado-(b) oligosacáridos de H2O en el 1200-900 cm-1 de la región. (A) melibiosa (6-O-un-D-galactopiranosil D-glucosa, concentración: 1,45 M, paso de luz: 6 mm), (b) de D-lactosa (4-O-b-Dgalactopyranosyl D-glucosa, concentración: 0,39 M, paso de luz: 12 mm) parece ser el método más prometedor (tanto en términos de practicidad y fiabilidad), ha sido implementado en una paquete comercial de software de la mecánica cuántica [32]. La determinación estructural de uso de estos teóricos cuánticos enfoques consiste en la predicción de los espectros de VCD para diferentes estructuras posibles y comparándolas con el espectro experimental. A partir de esta comparación, la estructura predominante se puede deducir. Precisa cuántica predicciones mecánicas de VCD puede, en el presente tiempo, se realizarán para las moléculas de tamaño moderado. Tal aplicaciones todavía no son posibles de biomoléculas de gran tamaño, tales como las proteínas. 6 Conclusiones Distintos espectros de la estructura de las correlaciones se han encontrado cómo influye la observada espectros de VCD y de las estructuras moleculares de una variedad de sistemas biomoleculares. Estas correlaciones hacer que la espectroscopia de VCD una poderosa estructura herramienta. Los desarrollos comerciales de instrumentos, VCD y de software para las predicciones de la mecánica cuántica VCD, hecho mucho más fácil ahora, para los químicos sintéticos, productos farmacéuticos químicos y biólogos estructurales, para practicar el VCD espectroscopia de forma rutinaria. Agradecimientos Agradecemos a la NSF (CHE9707773) y

La Universidad de Vanderbilt para el apoyo de subvención. Damos las gracias a James R. McBride para registrar el espectro de poli (L-lisina) y el Dr. PK Bose para registrar los espectros de oligosacáridos.